O que quer que você esteja fazendo, seja dirigindo um carro, correndo ou até mesmo no seu momento mais preguiçoso, comendo batatas fritas e assistindo TV no sofá, há todo um conjunto de maquinaria molecular dentro de cada uma de suas células trabalhando duro. Esse maquinário, pequeno demais para ser visto a olho nu ou mesmo com muitos microscópios, cria energia para a célula, fabrica suas proteínas, faz cópias de seu DNA e muito mais.
Entre essas máquinas, e uma das mais complexas, está algo conhecido como complexo de poros nucleares (NPC). O NPC, que é feito de mais de 1.000 proteínas individuais, é um guardião incrivelmente discriminador do núcleo da célula, a região ligada à membrana dentro de uma célula que contém o material genético dessa célula. Qualquer coisa que entre ou saia do núcleo tem que passar pelo NPC em seu caminho.

O papel do NPC como guardião do núcleo significa que é vital para as operações da célula. Dentro do núcleo, o DNA, o código genético permanente da célula, é copiado em RNA. Esse RNA é então transportado para fora do núcleo para que possa ser usado para fabricar as proteínas de que a célula precisa. O NPC garante que o núcleo obtenha os materiais necessários para sintetizar o RNA, ao mesmo tempo que protege o DNA do ambiente hostil fora do núcleo e permite que o RNA deixe o núcleo depois de ter sido produzido.

"É um pouco como um hangar de avião onde você pode consertar 747s, e a porta se abre para deixar o 747 entrar, mas há uma pessoa lá que pode impedir que uma única bola de gude saia enquanto as portas estão abertas", diz André, do Caltech. Hoelz, professor de química e bioquímica e bolsista do Howard Hughes Medical Institute. Há mais de duas décadas, Hoelz estuda e decifra a estrutura do NPC em relação à sua função. Ao longo dos anos, ele foi desvendando seus segredos, desvendando-os pedaço por pedaço por pedaço.

As implicações desta pesquisa são potencialmente enormes. O NPC não é apenas central para as operações da célula, mas também está envolvido em muitas doenças. Mutações no NPC são responsáveis ​​por alguns cânceres incuráveis, por doenças neurodegenerativas e autoimunes, como esclerose lateral amiotrófica (ELA) e encefalopatia necrosante aguda, e por doenças cardíacas, incluindo fibrilação atrial e morte súbita cardíaca precoce. Além disso, muitos vírus, incluindo o responsável pelo COVID-19, visam e desligam o NPC durante o curso de seus ciclos de vida.

Agora, em um par de artigos publicados na revista Science , Hoelz e sua equipe de pesquisa descrevem dois avanços importantes:a determinação da estrutura da face externa do NPC e a elucidação do mecanismo pelo qual proteínas especiais agem como uma cola molecular para manter o NPC unido.

Um quebra-cabeça 3D muito pequeno

Em seu artigo intitulado "Arquitetura da face citoplasmática do poro nuclear", Hoelz e sua equipe de pesquisa descrevem como mapearam a estrutura do lado do NPC voltado para fora do núcleo e para o citoplasma das células. Para fazer isso, eles tiveram que resolver o equivalente a um quebra-cabeça 3D muito pequeno, usando técnicas de imagem como microscopia eletrônica e cristalografia de raios X em cada peça do quebra-cabeça.

Stefan Petrovic, estudante de pós-graduação em bioquímica e biofísica molecular e um dos co-primeiros autores dos artigos, diz que o processo começou com a bactéria Escherichia coli (uma cepa de bactéria comumente usada em laboratórios) que foram geneticamente modificadas para produzir as proteínas que compõem o NPC humano.

"Se você entrar no laboratório, poderá ver essa parede gigante de frascos em que as culturas estão crescendo", diz Petrovic. "Expressamos cada proteína individual em células de E. coli, quebramos essas células e purificamos quimicamente cada componente proteico".

Uma vez que a purificação – que pode exigir até 1.500 litros de cultura bacteriana para obter material suficiente para um único experimento – foi concluída, a equipe de pesquisa começou a testar meticulosamente como as peças do NPC se encaixavam.

George Mobbs, pesquisador associado de pós-doutorado sênior em química e outro co-primeiro autor do artigo, diz que a montagem aconteceu de forma "passo a passo"; em vez de despejar todas as proteínas juntas em um tubo de ensaio ao mesmo tempo, os pesquisadores testaram pares de proteínas para ver quais se encaixariam, como duas peças de quebra-cabeça. Se fosse encontrado um par que se encaixasse, os pesquisadores testariam as duas proteínas agora combinadas contra uma terceira proteína até encontrarem uma que se encaixasse nesse par, e então a estrutura de três peças resultante seria testada contra outras proteínas, e assim sobre. Atravessar as proteínas dessa maneira acabou produzindo o resultado final de seu artigo:uma fatia de 16 proteínas que é repetida oito vezes, como fatias de uma pizza, para formar a face do NPC.

“Relatamos a primeira estrutura completa de toda a face citoplasmática do NPC humano, juntamente com uma validação rigorosa, em vez de relatar uma série de avanços incrementais de fragmentos ou porções com base em observações parciais, incompletas ou de baixa resolução”, diz Si ​​Nie , pesquisador associado de pós-doutorado em química e também co-primeiro autor do artigo. "Decidimos esperar pacientemente até obter todos os dados necessários, relatando uma enorme quantidade de novas informações".

Seu trabalho complementou a pesquisa conduzida por Martin Beck, do Instituto Max Planck de Biofísica em Frankfurt, na Alemanha, cuja equipe usou tomografia crioeletrônica para gerar um mapa que forneceu os contornos de um quebra-cabeça no qual os pesquisadores tiveram que colocar as peças. Para acelerar a conclusão do quebra-cabeça da estrutura do NPC humano, Hoelz e Beck trocaram dados há mais de dois anos e, em seguida, construíram estruturas de todo o NPC de forma independente. "O mapa de Beck substancialmente melhorado mostrou muito mais claramente onde cada peça do NPC - para o qual determinamos as estruturas atômicas - tinha que ser colocada, semelhante a uma moldura de madeira que define a borda de um quebra-cabeça", diz Hoelz.

As estruturas determinadas experimentalmente das peças NPC do grupo Hoelz serviram para validar a modelagem do grupo Beck. "Colocamos as estruturas no mapa de forma independente, usando abordagens diferentes, mas os resultados finais concordaram completamente. Foi muito gratificante ver isso", diz Petrovic.

"Construímos uma estrutura na qual muitos experimentos podem agora ser feitos", diz Christopher Bley, pesquisador sênior de pós-doutorado associado em química e também co-primeiro autor. "Nós temos essa estrutura composta agora, e ela permite e informa futuros experimentos sobre a função do NPC, ou mesmo doenças. Há muitas mutações no NPC que estão associadas a doenças terríveis, e saber onde elas estão na estrutura e como elas se unir pode ajudar a projetar o próximo conjunto de experimentos para tentar responder às perguntas sobre o que essas mutações estão fazendo."

'Este elegante arranjo de macarrão espaguete'

No outro artigo, intitulado "Arquitetura do linker-scaffold no poro nuclear", a equipe de pesquisa descreve como determinou toda a estrutura do que é conhecido como linker-scaffold do NPC - a coleção de proteínas que ajudam a manter o NPC unido ao mesmo tempo que fornece a flexibilidade necessária para abrir e fechar e ajustar-se às moléculas que passam.

Hoelz compara o NPC a algo construído com peças de Lego que se encaixam sem travar e, em vez disso, são amarradas por elásticos que os mantêm principalmente no lugar, enquanto ainda permitem que eles se movam um pouco.

"Eu chamo esses pedaços de cola não estruturados de 'matéria escura do poro'", diz Hoelz. "Este elegante arranjo de macarrão espaguete mantém tudo junto."

O processo para caracterizar a estrutura do linker-scaffold foi praticamente o mesmo que o processo usado para caracterizar as outras partes do NPC. A equipe fabricou e purificou grandes quantidades de muitos tipos de proteínas de ligação e andaimes, usou uma variedade de experimentos bioquímicos e técnicas de imagem para examinar interações individuais e testou-as peça por peça para ver como elas se encaixam no NPC intacto.

Para verificar seu trabalho, eles introduziram mutações nos genes que codificam cada uma dessas proteínas de ligação em uma célula viva. Como eles sabiam como essas mutações mudariam as propriedades químicas e a forma de uma proteína ligante específica, tornando-a defeituosa, eles podiam prever o que aconteceria com a estrutura dos NPCs da célula quando essas proteínas defeituosas fossem introduzidas. Se os NPCs da célula fossem funcional e estruturalmente defeituosos da maneira que esperavam, eles sabiam que tinham o arranjo correto das proteínas de ligação.

"Uma célula é muito mais complicada do que o sistema simples que criamos em um tubo de ensaio, por isso é necessário verificar se os resultados obtidos em experimentos in vitro se sustentam in vivo", diz Petrovic.

A montagem da face externa do NPC também ajudou a resolver um mistério de longa data sobre o envelope nuclear, o sistema de membrana dupla que envolve o núcleo. Como a membrana da célula dentro da qual reside o núcleo, a membrana nuclear não é perfeitamente lisa. Em vez disso, é cravejado de moléculas chamadas proteínas integrais de membrana (IMPs) que servem em uma variedade de papéis, inclusive atuando como receptores e ajudando a catalisar reações bioquímicas.

Embora os IMPs possam ser encontrados nos lados interno e externo do envelope nuclear, não estava claro como eles realmente viajavam de um lado para o outro. De fato, como os IMPs estão presos dentro da membrana, eles não podem simplesmente deslizar pelo canal de transporte central do NPC como fazem as moléculas flutuantes.

Uma vez que a equipe de Hoelz entendeu a estrutura do linker-scaffold do NPC, eles perceberam que ele permite a formação de pequenas "calhas" ao redor de sua borda externa que permitem que os IMPs passem pelo NPC de um lado do envelope nuclear para o outro enquanto permanecendo sempre embutido na própria membrana.

"Isso explica muitas coisas que eram enigmáticas no campo. Estou muito feliz em ver que o canal de transporte central realmente tem a capacidade de dilatar e formar portas laterais para esses IMPs, como havíamos proposto originalmente há mais de uma década. ", diz Hoelz.

Em conjunto, as descobertas dos dois artigos representam um salto na compreensão dos cientistas de como o NPC humano é construído e como ele funciona. As descobertas da equipe abrem as portas para muito mais pesquisas. “Depois de determinar sua estrutura, agora podemos nos concentrar em trabalhar as bases moleculares para as funções do NPC, como como o mRNA é exportado e as causas subjacentes das muitas doenças associadas ao NPC com o objetivo de desenvolver novas terapias”, diz Hoelz.

Os artigos que descrevem o trabalho aparecem na edição de 10 de junho da revista Science . + Explorar mais

Bioquímicos resolvem a estrutura do guardião do DNA da célula