p O número de proteínas no corpo humano, conhecido coletivamente como o proteoma, é vasto. Algo entre 80, 000 e 400, 000 proteínas circulam em nossas células, tecidos e órgãos, desempenhar um amplo leque de funções essenciais para a vida. Quando as proteínas dão errado, eles são responsáveis ​​por uma miríade de doenças graves. p Agora, pesquisadores do Biodesign Center for Applied Structural Discovery e da Escola de Ciências Moleculares da ASU, junto com seus colegas, investigar uma classe de proteínas extremamente importante, que adornam as membranas externas das células. Essas proteínas de membrana geralmente atuam como receptores para moléculas de ligação, iniciar sinais que podem alterar o comportamento celular de várias maneiras.

p Uma nova abordagem para adquirir dados estruturais de proteínas de membrana em detalhes surpreendentes é descrita no novo estudo. Métodos de microscopia eletrônica criogênica (ou crio-EM), um conjunto inovador de ferramentas, é usado. Avançar, o uso da chamada cristalização de LCP e difração de elétrons microcristais (MicroED) ajudam a desvendar detalhes estruturais de proteínas que têm sido amplamente inacessíveis por meio de abordagens convencionais como a cristalografia de raios-X.

p Os resultados descrevem o primeiro uso de microcristais embutidos em LCP para revelar detalhes estruturais de proteínas de alta resolução usando MicroED. A nova pesquisa está na capa da edição atual da revista Cell Press Estrutura .

p "LCP foi um grande sucesso na cristalização de proteínas de membrana, de acordo com Wei Liu, um autor correspondente do novo estudo. "A nova aplicação extensiva de LCP-MicroED oferece a promessa de abordagens aprimoradas para determinação estrutural de alvos proteicos desafiadores. Esses projetos estruturais podem ser usados ​​para facilitar o projeto de novos medicamentos terapêuticos a partir de percepções mais precisas."

p Uma classe de proteínas de membrana de interesse particular são os receptores acoplados à proteína G (GPCRs), que formam o maior e mais variado grupo de receptores de membrana encontrados em organismos eucarióticos, incluindo humanos.

p As atividades fisiológicas dos GPCRs são tão importantes que eles são um alvo principal para uma ampla gama de drogas terapêuticas. É aqui que surgem problemas, no entanto, já que determinar a estrutura detalhada das proteínas da membrana - um precursor essencial para o design preciso de medicamentos - muitas vezes apresenta enormes desafios.

p A técnica de cristalografia de raios X tem sido usada para investigar as estruturas em escala atômica e até mesmo o comportamento dinâmico de muitas proteínas. Aqui, amostras cristalizadas da proteína em estudo são atingidas com um feixe de raios-X, causando padrões de difração, que aparecem em uma tela. A montagem de milhares de instantâneos de difração permite que uma imagem estrutural 3-D de alta resolução seja montada com o auxílio de computadores.

p No entanto, muitas proteínas de membrana, incluindo GPCRs, não forme grande, cristais bem ordenados apropriados para cristalografia de raios-X. Avançar, tais proteínas são delicadas e facilmente danificadas pela radiação-X. Contornar o problema exigiu o uso de dispositivos especiais conhecidos como lasers de elétrons livres de raios-X ou XFELS, que pode fornecer uma explosão brilhante de luz de raios-X durando meros femtossegundos, (um femtossegundo é igual a um quatrilionésimo de segundo ou aproximadamente o tempo que um raio de luz leva para atravessar o diâmetro de um vírus). A técnica de cristalografia de raios X de femtosegundo serial permite aos pesquisadores obter uma imagem de refração antes que a amostra cristalizada seja destruída.

p No entanto, a cristalização de muitas proteínas de membrana permanece uma arte extremamente difícil e imprecisa e apenas um punhado dessas gigantescas máquinas XFEL existem no mundo.

p Entre na microscopia eletrônica criogênica e MicroED. Esta técnica inovadora envolve cristais de proteína de congelamento instantâneo em uma fina camada de gelo, em seguida, submetendo-os a um feixe de elétrons. Como no caso da cristalografia de raios-X, o método usa padrões de difração, desta vez de elétrons em vez de raios-X, para montar as estruturas detalhadas finais.

p O MicroED se destaca na coleta de dados de cristais muito pequenos e irregulares para serem usados ​​na cristalografia convencional de raios-X. No novo estudo, pesquisadores usaram duas técnicas avançadas em conjunto para produzir imagens de difração de alta resolução de duas proteínas modelo importantes:Proteinase K e o receptor de adenosina A2A, cujas funções incluem a modulação de neurotransmissores no cérebro, vasodilatação cardíaca e resposta imune das células T.

p As proteínas foram incorporadas em um tipo especial de cristal conhecido como fase cúbica lipídica ou cristal LCP, que imita o ambiente nativo em que tais proteínas ocorrem naturalmente. As amostras de LCP foram então submetidas a microscopia eletrônica, usando o método MicroED, que permite a geração de imagens extremamente finas, cristais de tamanho submicrométrico. Avançar, a rotação contínua de cristais de LCP sob o microscópio eletrônico permite que vários padrões de difração sejam adquiridos a partir de um único cristal com um nível extremamente baixo, dose de elétrons livre de danos.

p A capacidade de examinar proteínas que só podem formar micro ou nanocristais abre a porta para a determinação estrutural de muitas proteínas de membrana vitalmente importantes que escaparam aos meios convencionais de investigação, particularmente GPCRs.