Quando uma gota estacionária contendo um soluto em um solvente volátil evapora, o fluxo na gota pode formar padrões complexos. Os pesquisadores examinaram esse transporte na evaporação de gotículas sésseis em solventes. Em um novo relatório agora publicado em Avanços da Ciência , Bryan A. Nerger e uma equipe de cientistas em engenharia química e biológica, e biologia molecular na Universidade de Princeton, NÓS., demonstrou fluxo em evaporação de gotículas sésseis aquosas contendo o colágeno tipo I de polímero de automontagem. O material pode ser usado para projetar redes hidratadas de fibras de colágeno alinhadas. A equipe observou o efeito Marangoni (termo originado da propagação de gotas de óleo na água) para direcionar a montagem de fibras de colágeno em áreas em escala milimétrica em relação à umidade ambiental e à forma geométrica da gota. Nerger et al. células do músculo esquelético incorporadas e cultivadas nas gotículas de evaporação para observar sua orientação coletiva e subsequente diferenciação para miotubos em resposta às redes alinhadas de colágeno. O trabalho demonstra um simples, abordagem sintonizável e de alto rendimento para projetar hidrogéis fibrilares alinhados para criar materiais biomiméticos carregados de células.

A miríade de padrões de deposição de sólidos que surgem do fluxo de fluido impulsionado pela evaporação foi relatada pela primeira vez por Robert Brown em 1828 e posteriormente investigada para uma variedade de aplicações atuais, incluindo microfabricação e impressão a jato de tinta. O anel de café ou fluxo radial para fora também pode ocorrer quando o solvente é volátil, e o fluxo de Marangoni impulsionado pelo calor latente de evaporação é suprimido. Os fluxos de Marangoni decorrentes de gradientes térmicos ou impulsionados por soluto na tensão superficial também podem gerar fluxos de recirculação. Os pesquisadores descreveram o fluxo em gotículas de evaporação principalmente no contexto de partículas suspensas em solventes que evaporam completamente. Nesse trabalho, Nerger et al. mostrou como o fluxo em gotículas de evaporação pode regular a taxa de auto-montagem de proteínas e controlar o alinhamento de redes de proteínas carregadas de células fibrosas. A equipe demonstrou que o fluxo na evaporação de gotículas aquosas de colágeno tipo I neutralizado gerou redes de fibras de colágeno alinhadas.

Os efeitos de Marangoni térmico e movido a soluto permitiram o fluxo radial na gota de evaporação para orientar as fibras de colágeno através da automontagem. Os cientistas ajustaram a orientação das fibras alterando a taxa de automontagem, umidade ambiental e geometria da gota. As células do músculo esquelético incorporadas nas gotículas de evaporação orientadas e diferenciadas em miotubos multinucleados em resposta ao alinhamento das fibras de colágeno e apenas uma fração da água evaporada da gotícula, dando origem a uma construção de hidrogel carregada de células. O hidrogel resultante tem amplas aplicações para projetar andaimes biomiméticos para estudos em engenharia de tecidos, biologia do desenvolvimento e materiais de automontagem.

Auto-montagem de fibras de colágeno em gotículas de colágeno em evaporação

A equipe soltou soluções neutralizadas de colágeno tipo I em placas de cultura de fundo de vidro tratadas com ultravioleta (UV) / ozônio, controlando a umidade relativa (UR) das placas de cultura antes de depositar o colágeno dentro da placa. Eles então colocaram a placa de cultura em uma placa de Petri selada maior para iniciar a automontagem do colágeno. O colágeno constrói-se automaticamente enquanto a água evapora da gota, e a equipe visualizou a orientação das fibras de colágeno em três regiões distintas da gota, incluindo a borda, perto da borda, e o meio. A equipe observou as orientações das fibras de colágeno dentro da gota e mostrou sua variação dentro das gotas em evaporação.

Nerger et al. grânulos fluorescentes incorporados nas gotas para entender se a orientação das fibras de colágeno se correlacionava com os padrões internos de fluxo durante a evaporação. Eles então observaram o movimento dos grânulos e a automontagem do colágeno para sugerir que o fluxo de Marangoni impulsionava a recirculação dentro das gotículas em evaporação. Os movimentos do grânulo foram consistentes com os padrões de alinhamento das fibras de colágeno ao longo da gota. Os cientistas quantificaram o fluxo calculando parâmetros médios de tempo e conjunto, incluindo deslocamento quadrático médio (MSD), deslocamento total, e velocidade das trajetórias do cordão. As medições mostraram maior mobilidade para grânulos na região próxima à borda da gota, enquanto a velocidade média dos grânulos era cinco a dez vezes maior nas regiões da borda ou do meio.

Ajuste do alinhamento e diâmetro da fibra de colágeno

Nerger et al. a seguir explorou o alinhamento das fibras de colágeno nas gotículas onde a velocidade do fluxo de Marangoni era proporcional à taxa de evaporação. O alinhamento das fibras de colágeno depende da taxa de cisalhamento induzida pelo fluxo. Portanto, a equipe levantou a hipótese de que eles poderiam ajustar o alinhamento do colágeno ajustando a variação de UR (umidade relativa). O processo permitiu que eles também controlassem a taxa de evaporação das gotas. Eles testaram isso usando água pura e soluções de sal saturadas na placa de cultura e usaram microscopia de reflexão confocal (CRM) para mostrar que o alinhamento das fibras de colágeno diminuiu sob as condições de alta UR fornecidas por água ou cloreto de sódio (NaCl). Quando eles diminuíram a UR usando brometo de lítio (LiBr), a fração de alinhamento diminuiu, enquanto aumenta o diâmetro do colágeno devido à redução da cinética de automontagem do colágeno. O RH regulou o alinhamento das fibras de colágeno, regulando as taxas de fluxo. Taxas de fluxo suficientemente grandes podem, portanto, interromper a formação de uma rede de colágeno estável. A equipe também variou o pH da solução e deduziu o alinhamento da fibra de colágeno como uma função da cinética de automontagem em uma gota de evaporação. Os cientistas conseguiram controlar o padrão de alinhamento do colágeno controlando a geometria da gota.

Padronização de alinhamento de células para diferenciação

Redes alinhadas de fibras de colágeno podem normalmente influenciar o comportamento fisiológico de células e tecidos, bem como processos biológicos, como um caminho promissor na engenharia de tecidos. Para determinar se as células permaneceram viáveis ​​no colágeno após a evaporação das gotículas, Nerger et al. incluiu câncer de mama humano ou células do músculo esquelético na solução de colágeno antes da aplicação de gotas e da evaporação. As células do câncer de mama orientadas radialmente ao longo das fibras de colágeno na gota, e as células do músculo esquelético orientadas na direção do alinhamento das fibras de colágeno. Após quatro dias em cultura de células, as células do músculo esquelético se diferenciaram para formar miotubos multinucleados alinhados na direção das fibras de colágeno ao longo da gota. Para confirmar a influência do colágeno na diferenciação, os cientistas cultivaram células em um substrato de vidro nas mesmas condições e observaram que as estruturas sarcômeras eram contrastantemente menores e orientadas aleatoriamente. Os dados demonstraram como as gotículas de evaporação de colágeno padronizaram o alinhamento e a diferenciação das células em escalas milimétricas.

Desta maneira, Bryan A. Nerger e colegas usaram o fluxo de Marangoni gerado na evaporação de gotículas de colágeno tipo I para regular a automontagem do colágeno e produzir redes tridimensionais (3-D) com alinhamento ajustável de fibras, diâmetro e porosidade. Eles impediram a evaporação completa das gotículas para formar redes de fibras de colágeno hidratado 3-D para apoiar o crescimento e a diferenciação de células de mamíferos. O sistema tem potencial para gerar um simples, abordagem de alto rendimento para incorporar explantes de tecido ou organóides em redes alinhadas de colágeno. A abordagem permitirá a produção de construtos de tecido alinhados fisiologicamente relevantes para amplas aplicações em ciências da vida e medicina.

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