Uma técnica de imagem de uma única molécula, chamado de intensificação de fluorescência induzida por proteína (PIFE), ganhou força nos últimos anos como uma ferramenta popular para observar as interações DNA-proteína com precisão nanométrica. Ainda, de acordo com um novo estudo KAUST, laboratórios de pesquisa não têm usado a técnica em todo o seu potencial.

O ensaio PIFE baseia-se na ideia de que o DNA marcado com um corante fluorescente brilhará mais quando as proteínas forem ligadas nas proximidades. Em muitos casos, isso é verdade - o que levou muitos cientistas a adotar o PIFE em vez de outras técnicas de trabalho intensivo que dependem da marcação dupla de proteínas e DNA.

Mas os alunos de graduação de Samir Hamdan, Fahad Rashid, Manal Zaher e Vlad-Stefan Raducanu perceberam que a ligação da proteína aos complexos DNA-corante às vezes também poderia ter o efeito oposto. Em vez de aumentar o sinal fluorescente, as interações de proteínas às vezes podem diminuir o brilho, dependendo de certas propriedades do sistema.

Hamdan credita a curiosidade de seus alunos por fazer essa observação e detalhar como ela funciona. A inspiração do trabalho anterior de Rashid levou a equipe ao fenômeno que eles chamam de extinção de fluorescência induzida por proteína (PIFQ). E como Rashid explica, "Decidimos definir melhor as condições que levam a explosões ou colapsos fluorescentes."

Por meio de uma combinação de análises experimentais e computacionais, a equipe KAUST mostrou que o estado inicial de fluorescência do complexo DNA-corante determina se PIFE ou PIFQ resultará após a ligação às proteínas. Sem este conhecimento, a probabilidade de qualquer evento se tornar equivalente a um cara ou coroa, o que pode comprometer a interpretação mecanicista dos resultados laboratoriais.

"Quando a compreensão desse estado inicial é obtida da fluorescência e do trabalho estrutural, a antecipação de qualquer efeito torna-se experimentalmente viável, "Raducanu explica.

Fatores como a sequência do DNA e a posição do corante podem inclinar a balança para o PIFE ou PIFQ; a equipe do KAUST ficou tão boa em interpretar o código molecular que poderia prever com precisão o que aconteceria simplesmente medindo como esses parâmetros influenciam o estado inicial de fluorescência do sistema DNA-corante.

"Transformamos cada medição em um jogo, "Zaher diz, "e estamos felizes em dizer que nossa hipótese previu o resultado em mais de 90 por cento das vezes!"

Esses novos insights devem expandir drasticamente o alcance e a promessa experimental desta poderosa ferramenta de imagem de uma única molécula, prevê Raducanu. "Ao apresentar o PIFQ, oferecemos aos pesquisadores da área a possibilidade de abordar várias questões biológicas onde o PIFE pode não ter sido testemunhado, " ele diz.

Os cientistas também podem optar por combinar PIFE e PIFQ para decifrar processos de várias etapas e multiproteínas com apenas uma única construção de DNA-corante.

"Levar em consideração a natureza dependente do contexto da modulação da fluorescência no sistema DNA-corante abre a porta para muitas possibilidades no projeto experimental que podem ser adaptadas às necessidades dos pesquisadores, "Diz Zaher.

"Agora, antecipamos que a interpretação dos dados e a atribuição de eventos moleculares a partir de dados de uma única molécula se tornará mais fácil e precisa, "Rashid acrescenta.