Um grupo de químicos do Institute of Transformative Bio-Molecules (ITbM), Universidade de Nagoya, desenvolveu um novo infravermelho próximo (NIR) que emite corante fluorescente fotoestável PREX 710 (corante xanteno fotorresistente que pode ser excitado em 710 nanômetros) para ter usos que variam de imagem de molécula única de longo prazo a imagens profundas in vivo, de acordo com um estudo relatado na revista Angewandte Chemie International Edition .

PREX 710 tem uma estrutura molecular que consiste em uma fração de óxido de fosfina (P =O) no lugar do oxigênio em seu núcleo de xanteno tricíclico fundido, e 2 grupos metoxi (OMe) no anel aromático periférico, que permite que o corante seja absorvido e emitido na região NIR, e é responsável por sua alta química e fotoestabilidade, respectivamente. Além disso, o éster NHS PREX 710 pode ser quimicamente ligado a biomoléculas, incluindo proteínas, açúcares, e pequenos ligantes orgânicos, o que pode levar a observações de várias estruturas e eventos em células vivas.

Juntamente com os pesquisadores da RIKEN e da Ehime University, a equipe descobriu que o PREX 710 pode ser usado para imagens fluorescentes de molécula única em condições fisiológicas. A alta fotoestabilidade do PREX 710 permite imagens repetidas, e suas propriedades específicas de absorção / emissão de luz na região NIR, permite imagens multicoloridas com seu uso com outros corantes fluorescentes. Além disso, ligando o éster PREX 710 NHS a um polissacarídeo (dextrano), a equipe teve sucesso na imagem 3-D profunda in vivo de vasos sanguíneos em cérebros de camundongos. Isso foi possível devido à alta estabilidade química do PREX 710 na corrente sanguínea, bem como pelo uso de radiação NIR para examinar profundamente os tecidos. A alta fotoestabilidade, solubilidade em água e estabilidade química, junto com sua baixa citotoxicidade, e o uso de radiação NIR torna o PREX 710 uma ferramenta poderosa para visualizar processos e estruturas moleculares por longos períodos sem fotodegradação dentro de organismos vivos.

A imagem por fluorescência é uma técnica em que uma proteína específica ou organela celular é marcada com uma sonda fluorescente e é usada para visualizar processos e estruturas de organismos sob um microscópio fluorescente. Embora muitos agentes de marcação fluorescente, como proteínas fluorescentes e pequenas moléculas orgânicas fluorescentes foram desenvolvidas até agora, a maioria deles usa radiação na região visível. As desvantagens de usar luz visível, como luzes azuis ou verdes, surgem de sua alta energia, o que pode causar danos às amostras vivas quando expostas por longos períodos. Além disso, quando as amostras são excitadas com luz visível, a autofluorescência das próprias amostras tende a interferir com os sinais das sondas fluorescentes. Também se sabe que biomoléculas como a hemoglobina tendem a absorver a luz visível, para que a luz não alcance as profundezas dos organismos, o que torna difícil visualizar vasos sanguíneos e órgãos vivos.

Esses problemas decorrentes de imagens com luz visível podem ser superados usando radiação NIR, que tem um comprimento de onda maior, portanto, menor energia, em comparação com a luz visível. Apesar disso, muitos dos corantes NIR desenvolvidos até agora são baseados em corantes cianina, que consistem em cadeias de polimetina (grupos metino (CH) conectados por ligações alternadas simples e duplas) que possuem heterociclos contendo nitrogênio ligados a cada extremidade da cadeia. A maioria dos corantes de cianina sofre de baixa estabilidade química e fotoestabilidade, tornando assim a bioimagem de longo prazo difícil com esses corantes devido ao fotobranqueamento ao longo do tempo. Embora agentes anti-desbotamento possam ser adicionados para prevenir fotobranqueamento, eles podem não ser aplicáveis ​​em experimentos com células vivas.

"O grupo Yamaguchi está interessado em fazer corantes fotoestáveis ​​para bioimagem que absorvem e emitem em diferentes comprimentos de onda, "diz o Dr. Masayasu Taki, um professor associado no grupo do professor Shigehiro Yamaguchi na ITbM, e um dos líderes deste estudo. “Sabe-se que os comprimentos de onda de excitação e emissão dos corantes aumentam com o aumento das ligações duplas conjugadas em sua estrutura, mas mais anéis tornam a síntese complicada e também leva a baixa solubilidade em água, o que não é ideal para imagens em condições fisiológicas. Portanto, decidimos sintetizar diferentes corantes, alterando os elementos no núcleo do anel de xanteno de oxigênio para fósforo. "

"Dr. Marek Grzybowski, um pesquisador de pós-doutorado em nosso grupo, tem trabalhado neste projeto, e desenvolveu a síntese de muitos dos corantes fluorescentes à base de rodamina recentemente desenvolvidos em nosso grupo, "descreve Taki.

Durante seus estudos, o grupo também descobriu que um dos derivados de PREX 710 era suscetível ao ataque de uma forma reduzida de glutationa (GSH), que é um tripeptídeo que atua como um antioxidante nas células. Embora a descoloração de corantes por GSH seja geralmente considerada uma desvantagem na imagem fluorescente ao vivo, o grupo descobriu que este corante poderia servir como uma sonda NIR promissora para monitorar o nível de GSH em células e tecidos vivos.

"Depois de sintetizar e testar vários derivados de xanteno, encontramos PREX 710, que exibiu química e fotoestabilidade excepcionais, e, assim, provou ser um fluoróforo emissivo NIR prático, que por si só é permeável à membrana e se localiza principalmente nas mitocôndrias de células HeLa vivas, "explica Taki." Ficamos muito animados em ver que, usando o PREX 710, pudemos visualizar componentes de células vivas por muitos minutos em comparação com apenas alguns segundos que poderiam ser alcançados com corantes convencionais. "

Em colaboração com o Dr. Yasushi Okada, um líder de equipe no RIKEN Center for Biosystems Dynamics Research, a equipe descobriu que o PREX 710 é aplicável para imagens fluorescentes de molécula única, uma técnica que é conhecida por exigir forte radiação de luz. Seus estudos mostram que, nas mesmas condições experimentais, 80% dos sinais fluorescentes de molécula única de PREX 710 podem ser detectados por 2 minutos, enquanto que metade dos sinais desapareceu em 20 segundos com Alexa Fluor 647 (corante de cianina). As experiências demonstram que o PREX 710 pode visualizar claramente cada molécula por períodos prolongados sem qualquer fotobranqueamento na ausência de agentes anti-desbotamento.

Além disso, a equipe conseguiu usar PREX 710 na imagem multicolor de células HeLa vivas. Uma vez que as propriedades de excitação e emissão NIR do PREX 710 diferem dos corantes fluorescentes de luz visível, O crosstalk espectral pode ser evitado para visualizar os componentes celulares, cada um corado com corantes diferentes. Por exemplo, imagem multicolor de células HeLa vivas foi possível após a coloração da membrana celular, núcleo e mitocôndria com corantes fluorescentes comercialmente disponíveis, como DiI e SiR-DNA, junto com PREX 710, respectivamente.

A utilidade prática do PREX 710 também foi demonstrada pela aplicação da sonda para imagens profundas in vivo, que foi realizado em colaboração com os drs. Takeshi Imamura e Ryosuke Kawakami da Ehime University. Usando o local de bioconjugação de PREX 710, dextran, um polissacarídeo composto por moléculas de glicose, foi marcado com fluorescência e injetado na corrente sanguínea através da veia da cauda do rato. A imagem 3-D de vasos sanguíneos no cérebro de camundongos pode ser construída devido ao alto brilho do PREX 710 na região NIR, que permite a gravação dos sinais de fluorescência no tecido profundo.

"Tivemos o prazer de demonstrar que PREX 710 e seus derivados são ferramentas úteis para a investigação da dinâmica de organismos vivos, tecidos, células, e moléculas, "diz Taki." Atualmente estamos trabalhando no desenvolvimento de outras sondas de fluorescência NIR que podem ser usadas para colorir proteínas específicas, bem como examinar estruturas e processos vivos com mais profundidade. Esperamos que isso leve à visualização e elucidação de vários fenômenos nos sistemas vivos, incluindo sintomas médicos, " ele diz.