O que acontece em uma célula quando a informação genética é traduzida em proteínas? Para estudar este processo, pesquisadores estudam uma biomolécula particular dentro da célula:ácido ribonucléico mensageiro, mRNA para breve. Essa biomolécula desempenha um papel importante em todos os processos celulares - e também é o foco de pesquisas conjuntas realizadas por dois grupos no Cluster de Excelência em Células em Movimento da Universidade de Münster. Um dos grupos é formado por bioquímicos e é liderado pela Prof. Andrea Rentmeister; a outra é formada por biólogos moleculares e é liderada pelo Dr. Sebastian Leidel.

Em sua colaboração interdisciplinar, os pesquisadores conseguiram, pela primeira vez, rotular quimioenzimaticamente uma mudança importante no RNA mensageiro - a chamada modificação m6A - e subsequentemente detectá-la por meio de métodos modernos de biologia molecular. "Esta nova abordagem nos permite localizar modificações no mRNA com um grau de precisão maior do que nunca, "diz Andrea Rentmeister, um professor do Cluster of Excellence que conduziu o estudo. Saber onde e em que medida as modificações de m6A ocorrem pode ajudar os pesquisadores a entender essa modificação nos processos fisiológicos e patológicos. O estudo foi publicado no Angewandte Chemie (Edição Internacional) jornal.

A informação genética do DNA é transcrita em RNA mensageiro em um processo conhecido como transcrição. Após a transcrição, O mRNA transporta a informação genética do núcleo da célula para o citoplasma. Lá, serve de guia para a produção de proteínas. As proteínas são os cavalos de batalha que executam todas as tarefas celulares.

Como DNA de fita dupla, O RNA de fita simples consiste em uma cadeia dos chamados nucleotídeos. No RNA, Contudo, também há muitas mudanças químicas nesses nucleotídeos - conhecidas como modificações de RNA. Essas modificações ocorrem após a leitura da informação genética. No processo, arranjos atômicos simples - os grupos metil - estão ligados aos nucleotídeos. "Uma modificação que está sendo muito debatida é a N6-metiladenosina, conhecido como m6A, para abreviar, "diz Andrea Rentmeister. Esta modificação é muito interessante porque parece ser responsável por uma série de processos biológicos, incluindo o relógio circadiano. Também parece desempenhar um papel nos processos patológicos, por exemplo, em algumas formas de câncer ou em infecções virais.

Os bioquímicos marcaram modificações de RNA quimioenzimaticamente

A fim de obter uma melhor compreensão do m6A, os pesquisadores procuraram descobrir onde exatamente no mRNA se localizava a modificação. Para rotular moléculas, os biólogos costumam usar anticorpos que se ligam a ele. Este método tem suas limitações, Contudo; os anticorpos podem se ligar não apenas às modificações do mRNA, mas também para nucleotídeos vizinhos. Isso torna difícil localizar as modificações com precisão. "Queríamos agora fazer a rotulagem com uma abordagem química, "Andrea Rentmeister explica. Pela primeira vez, ela e sua equipe usaram grupos propargil, um resíduo de hidrocarboneto ligeiramente mais longo.

Os pesquisadores acoplaram os grupos propargil ao co-substrato da enzima, e combinou todos os três componentes com moléculas de mRNA no tubo de ensaio. Em sua estrutura química, propargil é semelhante a uma molécula natural ligada por uma metiltransferase. As metiltransferases, por sua vez, são enzimas responsáveis ​​pela modificação do mRNA. Assim, as metiltransferases foram capazes de transferir o grupo propargil para o RNA. Usando a chamada química do clique, os cientistas foram capazes de isolar e purificar o RNA com grupos propargil.

Biólogos moleculares detectaram modificações de RNA usando sequenciamento de próxima geração

A fim de detectar as modificações especificamente marcadas, os pesquisadores usaram uma enzima especial para transcrever o mRNA de volta ao DNA. A fita de DNA resultante é uma cópia do RNA anterior e pode ser investigada usando métodos de biologia molecular. Os pesquisadores sequenciaram essa fita de DNA recém-sintetizada, lendo as sequências de nucleotídeos. Eles usaram o sequenciamento de última geração, o que lhes permitiu determinar as sequências de nucleotídeos de forma extremamente eficiente. "Este método nos permite analisar milhares de sequências em paralelo, "explica Sebastian Leidel.

Como os pesquisadores rotularam as modificações com os grupos propargil, as enzimas necessárias para a reescrita do RNA preso. Como resultado, eles falharam em transcrever o RNA de volta ao DNA. "As enzimas cessaram qualquer atividade nos locais marcados e geraram algum tipo de sinal de parada, "diz Katja Hartstock, um químico e autor principal da história. Os pesquisadores foram capazes de determinar esses sinais de parada durante o sequenciamento, o que significa que eles poderiam detectar os locais em que ocorreu a modificação do mRNA.

Após os experimentos iniciais no tubo de ensaio, os pesquisadores aplicaram seu novo método em uma cultura de células epiteliais humanas - células HeLa. Os pesquisadores alimentaram as células com um chamado precursor de aminoácido marcado com propargil, que as células "comiam, "e posteriormente iniciou a rotulagem. Conforme já estabelecido no tubo de ensaio, os grupos propargil se ligaram ao RNA com a ajuda de metiltransferases e permitiram a detecção dos locais de modificação do mRNA por sequenciamento de próxima geração.

O próximo passo que os pesquisadores querem dar é aplicar seu método a organismos vivos para estudar o significado da modificação em seu desenvolvimento. Os peixes-zebra são adequados para esse propósito, pois se desenvolvem muito rápido e as modificações são, portanto, transcritas mais rapidamente - e também removidas novamente mais rápido.