p Figura 1:Técnica relativamente simples e barata para visualizar o mecanismo de reciclagem celular (autofagia) em tempo real. O processo é baseado na ligação entre CB [7] e AdA. CB [7] é ligado ao corante fluorescente Cy3 (colorido em verde) e entra nos lisossomos, enquanto o AdA está ligado ao Cy5 fluorescente (colorido em vermelho) que se acumula na mitocôndria. No processo de autofagia, as duas organelas celulares se fundem, levando ao encontro de CB [7] e AdA. Os cientistas podem detectar a fusão, porque quando os dois corantes fluorescentes se aproximam, eles interagem uns com os outros através do mecanismo de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET). Desta maneira, a equipe de pesquisa pode analisar o processo de autofagia passo a passo. Crédito:Institute for Basic Science
p Uma equipe de pesquisadores do Centro de Auto-montagem e Complexidade, dentro do Institute for Basic Science (IBS) observaram um processo fisiológico normal, chamado de "alimentação própria", que as células usam para reciclar seus componentes. Eles desenvolveram uma técnica precisa que visualiza como as mitocôndrias, fábricas de energia das células, são fundidos com lisossomos, máquinas de reciclagem de células, para que o material seja destruído e reciclado. Uma vez que irregularidades neste mecanismo podem levar ao Alzheimer, Mal de Parkinson, e outras complicações, essa pesquisa pode ajudar a avanços futuros no diagnóstico de doenças degenerativas do cérebro e no desenvolvimento de medicamentos. O estudo foi publicado em
Angewandte Chemie International Edition . p O nome "autofagia" vem da língua grega e significa "autofagia". Por mais estranho que pareça, é um processo indispensável usado para limpar células de organelas e proteínas danificadas. Dentro dos lisossomos, velhas partes celulares são decompostas em seus blocos de construção, que são empregados para construir novos. Recentemente, A autofagia se tornou um campo de estudo muito ativo e foi o centro do Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina de Yoshinori Ohsumi em 2016.
p Um exemplo de organela celular que deve ser reciclada periodicamente é a mitocôndria. A regulamentação cuidadosa desse processo é essencial, e células que não se dividem regularmente, como células nervosas, são particularmente vulneráveis. Se as células acumulam mitocôndrias defeituosas, eles podem se danificar. Isto ocorre, por exemplo, nas doenças de Alzheimer e Parkinson, onde o acúmulo de mitocôndrias danificadas e proteínas agregadas leva à morte neuronal.
p Sabe-se que a autofagia (ou mitofagia, no caso específico das mitocôndrias) ocorre por fusão de duas organelas diferentes, neste caso:mitocôndrias e lisossomas. Contudo, observar o comportamento e a fusão de mitocôndrias e lisossomos dentro das células tem sido um desafio. A data, a maioria desses estudos baseia-se em proteínas fluorescentes ligadas a uma organela, o que permite aos cientistas observar apenas uma organela de cada vez. Além disso, as próprias proteínas fluorescentes são degradadas durante a autofagia, tornando difícil estudar com precisão o mecanismo.
p Figura 2:Estudo de autofagia com transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) entre o corante fluorescente esverdeado Cy3 e o corante fluorescente vermelho Cy5. Cy3 emite fluorescência com um comprimento de onda de pico de 563 nanômetros (linha preta), enquanto Cy5 em 670 nanômetros (linha vermelha). No experimento, Cy3 é anexado ao CB [7] e Cy5 ao AdA. Durante a autofagia, os dois corantes se aproximam e Cy3 transfere alguma energia para seu corante parceiro próximo Cy5, seguindo o fenômeno FRET. Os cientistas capturam o encontro dos dois corantes como um aumento na fluorescência com comprimento de onda de 644-800 nanômetros (linha azul). Crédito:Institute for Basic Science
p Os cientistas do IBS na POSTECH desenvolveram um procedimento quantitativo para visualizar mitocôndrias e lisossomos ao longo do tempo. A técnica relativamente simples e barata é mais precisa do que as atuais. Ele usa moléculas sintéticas ocas em forma de barril, conhecido como cucurbituril (CB [7]), que se liga com força de ligação excepcionalmente alta a uma molécula chamada adamantilamina (AdA) e não pode ser degradada pelos lisossomas. CB [7] foi decorado com um corante fluorescente (Cy3), enquanto AdA com outro corante (Cy5). Inicialmente, CB [7] -Cy3 entra nos lisossomos e Ada-Cy5 na mitocôndria, e então, quando as duas organelas se fundem no processo de reciclagem, CB [7] -Cy3 e Ada-Cy5 ligam-se. Desta maneira, a equipe de pesquisa acompanhou o comportamento de diferentes organelas e observou o processo de mitofagia ocorrendo em células vivas. Além disso, os experimentos mostraram que os dois compostos não são tóxicos para as células abaixo de uma dose de 800 nanomolar.
p "A parte mais desafiadora do experimento foi a escolha dos produtos químicos. Escolhemos produtos químicos com a hidrofilicidade certa, cobrar, e o tamanho molecular a ser incorporado seletivamente nas mitocôndrias e lisossomos, "explica PARK Kyeng Min, um dos autores correspondentes do estudo.
p Em termos mais técnicos, a novidade deste trabalho está na aplicação da transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET) ao estudo da autofagia. FRET é uma transferência de energia dependente da distância entre dois corantes fluorescentes diferentes; neste caso, Cy3 e Cy5. Quando os dois estão próximos o suficiente, Cy3 doa energia para Cy5. Os cientistas capturam o encontro dos dois corantes à medida que a transferência de energia de Cy3 para Cy5 leva a uma redução na intensidade de fluorescência de Cy3 em favor de um aumento na intensidade de emissão de Cy5.
p No futuro, uma técnica semelhante poderia ser usada para estudar os processos de autofagia que envolvem outras organelas celulares, como as fábricas de proteínas do aparelho de Golgi e do retículo endoplasmático.
