Isolamento do DNA genômico de folhas de amendoim:um guia passo a passo

Este protocolo descreve um método básico para extrair DNA genômico de folhas de amendoim usando uma abordagem simples e econômica.

Materiais:

* Folhas de amendoim (frescas ou congeladas)
* Nitrogênio líquido
* Argamassa e pilão
* 1,5 ml de microcentrífuga tubos
* 100 mm Tris-HCl (pH 8,0)
* EDTA de 25 mm (pH 8,0)
* 1,4 M NaCl
* 10% SDS (dodecil sulfato de sódio)
* Clorofórmio:álcool isoamílico (24:1)
* Isopropanol
* 70% de etanol
* RNase A Solution (10 mg/ml)
* Espectrofotômetro

Procedimento:

1. Preparação da amostra:
* Colete folhas de amendoim fresco ou congelado. Se estiver usando folhas congeladas, descongele -as à temperatura ambiente.
* Pesar aproximadamente 0,1-0,2 g de tecido foliar.
* Coloque as folhas em uma argamassa pré-refocada e moa-as em um pó fino usando nitrogênio líquido.

2. lysis:
* Transfira as folhas em pó para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
* Adicione 500 µl de tampão de lise (Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, EDTA 25 mM, pH 8,0, NaCl 1,4 M e 10% de SDS).
* Incubar o tubo a 65 ° C por 30 minutos com agitação suave ocasional. Esta etapa quebra as paredes e membranas celulares, liberando o DNA.

3. Remoção de proteínas :
* Adicione 200 µl de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) ao tubo.
* Agite o tubo vigorosamente por 10 minutos.
* Centrifugar o tubo a 10.000 x g por 10 minutos à temperatura ambiente. Esta etapa separa a solução em três camadas:camada aquosa (em cima), interfase (meio) e camada orgânica (inferior). O DNA está na camada aquosa.

4. precipitação do DNA:
* Transfira cuidadosamente a camada aquosa para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
* Adicione 0,5 volume de isopropanol ao tubo e misture suavemente. Isso precipitará o DNA fora da solução.
* Incubar o tubo a -20 ° C por 30 minutos.
* Centrifugar o tubo a 10.000 x g por 10 minutos a 4 ° C. O pellet de DNA se formará na parte inferior do tubo.

5. Lavagem e secagem:
* Remova o sobrenadante e lave o sedimento de DNA com 500 µl de etanol a 70%.
* Centrifugar o tubo a 10.000 x g por 5 minutos a 4 ° C.
* Remova o etanol e seque o pellet por 5 a 10 minutos.

6. Resuspensão e tratamento com RNase:
* Reduzir o sedimento de DNA em 50 µl de tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM, pH 8,0).
* Adicione 1 µl de solução RNase A (10 mg/ml) ao tubo.
* Incubar o tubo a 37 ° C por 30 minutos para remover qualquer RNA restante.

7. Quantificação de DNA e verificação de qualidade:
* Quantifique o DNA extraído usando um espectrofotômetro a 260 nm e 280 nm de comprimentos de onda. A razão de absorvância a 260 nm/280 nm deve estar entre 1,8 e 2,0, indicando DNA puro.

Notas:

* Este protocolo é uma orientação básica e pode precisar ser adaptada com base no material foliar específico e na qualidade desejada do DNA.
* Sempre use luvas e casacos de laboratório ao lidar com amostras biológicas.
* Verifique se todos os reagentes e equipamentos são estéreis para evitar a contaminação.
* Você também pode usar kits comerciais de extração de DNA para um processo mais simplificado e eficiente.

Outras aplicações:

* O DNA genômico isolado pode ser usado para várias aplicações de biologia molecular, incluindo:
* PCR (reação em cadeia da polimerase)
* Sequenciamento de DNA
* Análise genética
* Clonagem

Este protocolo fornece um método simples e econômico para isolar o DNA genômico das folhas de amendoim, abrindo caminho para várias pesquisas e aplicações.