Na biologia molecular, boa escolha de tampão e preparação para diferentes etapas de isolamento do DNA podem ser a diferença entre passar para a expressão da proteína ou abrir outro kit maxi-prep para começar de novo. Apesar de sua importância crucial, as receitas do buffer geralmente são apenas isso - receitas escritas sem explicação ou justificativa para os diferentes componentes. Um desses tampões é o glicose-tris-EDTA ou o tampão GTE.
Para que o GTE é usado?
O GTE é usado para ressuspender os grânulos de células bacterianas antes de lisar (abrir) as células e colher o DNA do plasmídeo dentro. A lisozima, que amolece as membranas celulares, é frequentemente adicionada juntamente com o tampão GTE. Conseguir uma suspensão homogênea de células inteiras durante esta etapa para que a solução de lise adicionada posteriormente possa chegar a todas as células é essencial para obter bons rendimentos de DNA. O GTE é projetado para fazer isso, ao mesmo tempo em que fornece um ambiente estável para o DNA.
Glicose para osmolaridade
50mM (milimolar) de açúcar de glicose é adicionado ao tampão GTE para manter a osmolaridade onde a concentração de soluto fora das células é perto do que dentro das células. Isso evita a lise celular prematura, que pode causar baixos rendimentos de DNA devido à agregação e degradação. Os outros componentes do tampão também contribuem para a osmolaridade da solução, mas a glicose, por ser um eletrólito, é uma boa opção, pois não interfere nas propriedades do tampão da solução.
Tris para estabilidade do pH
Tris é o nome abreviado de tris (hidroximetil) aminometano, que é um tampão de pH muito comum. No caso do tampão GTE, o sal ácido (Tris-HCl) é adicionado ao tampão a uma concentração de 25 mM. Isso mantém o pH da solução em um 8.0 quase fisiológico, um pH ideal para prevenir a hidrólise ácida (degradação) do DNA do plasmídeo e reações colaterais indesejadas dos outros componentes celulares.
EDTA impede a degradação do DNA
O EDTA, ou ácido etilenodiaminotetracético, captura ou "quela" os íons metálicos da solução, impedindo-os de participar de reações colaterais indesejadas. No buffer GTE, o EDTA é adicionado a 10 mM. Seu principal objetivo é o buffer de arredondar zinco, magnésio e cálcio livres, impedindo a degradação do DNA por certas vias que exigem esses metais.
Algumas dicas importantes
Mantenha o seu buffer GTE frio e faça-o em pequenas quantidades para impedir o crescimento de bactérias indesejadas. O açúcar e o pH controlado contribuem para um ótimo meio de crescimento. Sempre use água purificada. A água da torneira pode ter um excesso de íons metálicos dos canos, o que pode sobrecarregar a capacidade do EDTA de capturar. Se você suspeitar da presença de RNA interferente em sua amostra, adicione RNase A a 100 microgramas por mililitro ao seu buffer GTE para eliminar o problema.
