p Candida albicans é um patógeno fúngico humano notório que causa aftas e infecções sistêmicas graves. Fungos oportunistas C. albicans, que muitas vezes vivem discretamente na flora normal da pele humana e intestino, podem mudar de seu modo furtivo inofensivo para se tornarem patógenos agressivos, especialmente em pessoas cujo sistema imunológico já está comprometido por doenças pré-existentes ou terapias medicamentosas agressivas. Eles também podem formar biofilmes em dispositivos médicos, como cateteres e stents no corpo humano, levando a infecções e às vezes à morte. A ameaça representada pelas formas livres e ligadas ao biofilme do patógeno está crescendo constantemente, como cepas virulentas de C. albicans estão se tornando cada vez mais resistentes aos poucos medicamentos disponíveis para tratá-las. p Microbiologistas estão enfrentando enormes dificuldades em sua busca para combater a resistência a drogas de C. albicans e a formação de biofilme. Cada micróbio C. albicans é um organismo "diplóide", já que geralmente contém duas cópias de todo o seu genoma e de todos os genes codificados nele. Contudo, para entender o papel que um gene específico desempenha, os pesquisadores precisam ser capazes de excluir as duas cópias ao mesmo tempo, permitindo-lhes observar os efeitos da ausência total do gene, que tem sido um desafio difícil em C. albicans. Além disso, genes muitas vezes desempenham papéis muito semelhantes e às vezes redundantes em muitos processos, incluindo resistência a drogas e formação de biofilme, o que significa que mais de um gene precisa ser excluído para identificar aqueles genes cujas funções estão ligadas.

p Para abordar o desafio de deleção de gene em C. albicans, uma equipe colaborativa liderada por James Collins e George Church, dois membros do corpo docente do Instituto Wyss de Engenharia Inspirada na Biologia de Harvard, desenvolveram uma plataforma de "gene drive" baseada em CRISPR-Cas9 para criar cepas diplóides do patógeno em que ambas as cópias do gene poderiam ser eliminadas de forma eficiente. A técnica pode abrir caminho para uma melhor compreensão da resistência aos medicamentos e dos mecanismos de formação de biofilme, e por meio de pesquisas futuras, poderia ajudar a identificar novos alvos de drogas e terapias combinadas. O estudo é publicado em Nature Microbiology .

p A equipe aproveitou a descoberta de uma forma "haplóide" muito rara de C. albicans que, como os de outros fungos, contém apenas um conjunto de cromossomos com uma cópia de cada gene, mas eles podem ser combinados para criar facilmente a forma diplóide. "Usamos cepas haplóides de C. albicans e substituímos genes que queríamos eliminar por um 'gene drive' que previamente desenvolvemos e ajustamos à biologia específica de C. albicans. Após o acasalamento, esses 'elementos genéticos egoístas' passam a substituir a cópia normal do gene nos fungos diplóides, "disse Church, Ph.D., que é Professor de Genética na Harvard Medical School e de Ciências da Saúde e Tecnologia em Harvard e MIT. "A abordagem funcionou tão eficientemente que nos permitiu até mesmo deletar pares de genes diferentes simultaneamente com maior rendimento e explorar se suas funções estão relacionadas."

p A nova abordagem do gene drive é baseada no sistema CRISPR-Cas9, em que uma enzima Cas9 de corte de DNA é direcionada para duas regiões que flanqueiam um gene em fungos C. albicans haplóides por dois chamados RNAs guias (gRNAs). Depois que a sequência do gene alvo foi cortada, um cassete de unidade de gene projetado expressando todos os componentes Cas9 e gRNA é inserido em seu lugar. Quando dois fungos haplóides são acasalados para formar uma prole diplóide, o gene drive também substituirá a contraparte do gene no outro cromossomo, efetivamente excluindo inteiramente a versão original do organismo.

p Ao aplicar sua abordagem de exclusão de genes, a equipe foi capaz de identificar combinações de genes que agem sinergicamente no desafio de certas drogas, ou no desencadeamento da formação de biofilme. "Por exemplo, deletando os dois genes de codificação da bomba de efluxo CDR1 e CDR2, ou TPO3 e CDR2 juntos, tornou C. albicans altamente sensível ao fluconazol e outras drogas antifúngicas, sugerindo que alvejar dois mecanismos ao mesmo tempo pode ajudar a superar a resistência aos medicamentos, "disse Rebecca Shapiro, Ph.D., um pós-doutorado na equipe de Collins. Shapiro se juntou a Alejandro Chavez, Ph.D., como primeiros co-autores da publicação. Chávez é um ex-bolsista de pós-doutorado que trabalhou com Church e Collins; ele agora é professor assistente na Universidade de Columbia em Nova York. "Em ensaios de formação de biofilme, também descobrimos que a perda do gene do fator de adesão ALS3 sinergia com a perda de vários outros genes do fator de adesão, o que o torna um centro altamente interconectado de adesão de biofilme e um candidato interessante para explorar mais. "

p O estudo oferece novos avanços para a compreensão do difícil território da patogênese e da resistência aos medicamentos de C. albicans. "Agora podemos ter um controle muito melhor sobre como as redes genéticas que estão por trás da virulência de C. albicans estão organizadas, veja como eles respondem a perturbações ambientais e de drogas específicas, e assim descobrir novas vulnerabilidades, que no futuro pode levar a novos alvos de drogas e terapias combinadas, "disse Collins, Ph.D., que também é o professor Termeer de Engenharia Médica e Ciência no Massachusetts Institute of Technology (MIT) e Professor de Engenharia Biológica no MIT. "Além disso, nossa plataforma de matriz de unidade de gene pode ser um modelo para abordagens semelhantes em outros patógenos fúngicos, como a recém-emergente Candida auris, que é altamente resistente aos medicamentos e já foi marcada como uma ameaça pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças. "

p "Esta colaboração simbiótica entre os líderes do corpo docente de duas plataformas de tecnologia de habilitação do Wyss Institute, Jim Collins e George Church, levou a novos insights importantes sobre a biologia deste patógeno fúngico infeccioso e como ele desenvolve resistência, além de abrir um caminho totalmente novo para o design de terapias antifúngicas mais eficazes, "disse o Diretor Fundador do Wyss Institute, Donald Ingber, M.D., Ph.D., que também é o professor Judah Folkman de Biologia Vascular no HMS e do Programa de Biologia Vascular no Hospital Infantil de Boston, bem como Professor de Bioengenharia no SEAS.