De acordo com o website BioWeb da Universidade de Wisconsin, um primer de PCR é um oligonucleotídeo sintético curto (geralmente entre 18 e 25 bases de comprimento) usado para amplificar regiões específicas de DNA em uma técnica de biologia molecular conhecida como reação em cadeia da polimerase (PCR). . Tanto um primer direto quanto um reverso são necessários, projetados para serem complementos reversos da fita de DNA, para flanquear e se ligar à região de DNA desejada. Quando os cientistas querem realizar pesquisas sobre um gene específico ou região do DNA, eles primeiro precisam realizar PCR para adquirir o suficiente da região alvo para trabalhar. Projetar sequências de primers para a região de interesse pode ser necessário se eles ainda não estiverem disponíveis por meio de pesquisas publicadas anteriormente ou por meios comerciais.
Obtenha a seqüência de nucleotídeos do gene ou região de interesse e decida por quanto tempo um fragmento você deseja amplificar. O primer forward e reverse é projetado para ligar no início e no final do fragmento desejado. Normalmente, os métodos de PCR convencionais usam primers que flanqueiam uma região entre 100 a 1.000 pares de bases, enquanto os métodos de PCR em tempo real usam fragmentos com cerca de 50 a 200 pares de bases.
Decida onde na sequência você quer os primers mentir. Por exemplo, você pode querer a localização perto do fim 5 'ou 3' da seqüência ou no meio. Se desejar, designe a localização dos primers para abranger um intron.
Siga as diretrizes recomendadas para o projeto de primers. A amplificação bem-sucedida do produto de DNA depende da qualidade dos primers e certas variáveis são críticas.
Crie os primers com 18 a 24 bases de comprimento. Vincent R. Prezioso, Ph.D., da Brinkmann Instruments Inc., sugere que este comprimento é longo o suficiente para ser extremamente específico para a região de DNA desejada, mas suficientemente curto para se ligar (recozer) facilmente. A temperatura de fusão do primer (Tm) deve estar entre 55 e 80 graus Celsius, baixa o suficiente para permitir a fusão completa em ou acima de 90 graus Celsius, mas alta o suficiente para permitir o recozimento. O conteúdo GC (porcentagem de Gs e Cs na sequência) deve estar entre 40 e 60 por cento. A extremidade 3 'da seqüência de primers deve terminar em C ou G (chamado de grampo GC) para promover a ligação, uma vez que os nucleotídeos G e C têm ligações mais fortes, entretanto, evite ter três ou mais Gs ou Cs nos últimos cinco anos. bases da seqüência.
Evite ter corridas de quatro ou mais de uma base (como ACCCC ...) ou quatro ou mais repetições de di-nucleotídeo (como ATATATAT ...) porque elas podem causar erros de interpretação. Elaborar primers sem homologia intra-primer (mais de três bases que complementam dentro do próprio primer) ou homologia inter-primers (onde os primers forward e reverse possuem seqüências complementares). Isso pode causar auto-dímeros ou dímeros de iniciadores, onde os primers se ligam a si mesmos, em vez de se ligarem à sequência de DNA desejada.
Use recursos online e sites que auxiliam no projeto de primers ou ajudem a verificar sequências de primer para complementaridade ou o potencial para fazer estruturas secundárias como grampos de cabelo. Alguns sites de design de primers incluem o Primer3, do Instituto de Tecnologia de Massachusetts, o Primer-Blast, da National Center for Biotechnology Information, e o OligoAnalyzer, da Integrated DNA Technologies.
