O Western blot, uma técnica analítica usada para identificar uma proteína específica em uma determinada amostra, emprega a capacidade de uma enzima ou anticorpo primário marcado com fluorescência se ligar ao seu antígeno específico. É um processo de três etapas que começa com a eletroforese em gel, seguida por membrana de transferência e sondagem com anticorpos. A detecção de proteínas pode ser direta ou indireta, com o último usando um anticorpo secundário marcado direcionado contra o primário. Embora aceito como uma técnica de análise de proteínas de rotina, western blot tem limitações, bem como benefícios.
Vantagem: Sensibilidade
Um dos maiores argumentos a favor do western blot é a sua sensibilidade. Devido à sua capacidade de detectar apenas 0,1 nanogramas de proteína em uma amostra, a técnica pode teoricamente servir como uma ferramenta eficaz de diagnóstico precoce, detectando até mesmo a menor resposta imunogênica de um vírus ou bactéria em uma amostra de paciente. Um western blot indireto ainda se baseia nessa sensibilidade da capacidade do anticorpo secundário de amplificar a intensidade do sinal detectado pelo sistema de imagem. Maior sensibilidade significa que menos anticorpos são necessários para o teste, o que reduz significativamente os custos de laboratório.
Vantagem: Especificidade
A técnica de western blot deve sua especificidade a dois grandes fatores contribuintes. Primeiro, a eletroforese em gel classifica uma amostra em proteínas de tamanho, carga e conformação diferentes. Este processo em si é um enorme passo para a detecção, uma vez que as bandas formadas no gel já dão pistas sobre o tamanho da proteína ou polipéptido de interesse. A especificidade da interação anticorpo-antígeno serve como o segundo grande fator. Como os anticorpos específicos mostram afinidade por proteínas específicas, o processo pode detectar seletivamente uma proteína-alvo, mesmo em uma mistura de 300.000 proteínas diferentes.
Desvantagem: Propenso a resultados falsos ou subjetivos
Apesar de sua sensibilidade e especificidade, um western blot ainda pode produzir resultados errados. Resultados falso-positivos quando um anticorpo reage com uma proteína não intencional, que é o que freqüentemente acontece quando um paciente que está sendo testado para o HIV tem tuberculose ou várias infecções parasitárias. Um falso-negativo, por outro lado, pode facilmente resultar se proteínas maiores não tiverem tempo suficiente para se transferir adequadamente para a membrana. Manchas e processamentos inadequados geralmente produzem bandas distorcidas, desbotadas ou até múltiplas, tornando os resultados dos testes sujeitos à interpretação do técnico.
Desvantagem: Alto Custo e Demanda Técnica
O custo de um western blot é um composto de grandes gastos individuais de anticorpos marcados, analistas qualificados e equipamentos de laboratório. Um processo delicado, o western blotting requer precisão em cada etapa para a identificação adequada dos constituintes de uma amostra. Um pequeno erro na concentração do reagente ou no período de incubação pode ser desastroso para todo o processo. Finalmente, o equipamento necessário para detecção e geração de imagens - sistemas quimioluminescentes, fluorescentes, radioativos ou de detecção a laser - pode ser muito caro para a unidade média de microbiologia.
