A coloração de Gram é um procedimento de coloração diferencial que mostra quais bactérias são Gram-positivas ou Gram-negativas com base na cor da mancha. O álcool acetona é um reagente usado nesse processo para fornecer a diferenciação de cores. As bactérias gram-positivas têm uma camada peptidoglicana espessa e coloram-se roxas, enquanto os microrganismos Gram-negativos apresentam uma camada peptidoglicana pouco a nenhuma e coloram-de-rosa.
Primária Cristal de Mancha-Violeta

preparado, violeta de cristal é usado para manchar a amostra primeiro. Nesse ponto, as bactérias Gram-positivas e Gram-negativas aparecerão roxas. Normalmente, o cristal violeta é aplicado na lâmina por 30 segundos antes de lavar qualquer excesso de mancha com água. O cristal violeta pode aderir um pouco às camadas de peptidoglicano, para que nem toda a mancha primária seja lavada com água.
Iodo Mordente

O iodo é então adicionado à amostra por um minuto. Atua como mordente, que serve para fixar corantes em um processo de coloração. O iodo desempenha essa função ligando-se ao cristal violeta e criando um complexo insolúvel que adere muito melhor à espessa camada peptidoglicana encontrada nas células bacterianas Gram-positivas do que apenas o cristal violeta sozinho. Não existe uma etapa de lavagem com água após a adição do iodo.
Álcool descolorante

Tanto a acetona quanto o álcool etílico podem ser usados como agente descolorante. O álcool dissolve lipídios encontrados na membrana celular externa de bactérias Gram-negativas, permitindo que o complexo cristal violeta-iodo vaze para fora da camada mais fina de peptidoglicano. O álcool é adicionado por 10 a 20 segundos; é derramado na lâmina até todo o iodo ser lavado e o escoamento ficar incolor. Neste ponto do processo de coloração de Gram, as bactérias Gram-negativas são incolores, enquanto as bactérias Gram-positivas ainda retêm o cristal violeta. Uma vez terminado, o slide precisa ser lavado com água para interromper o efeito descolorante.
Counterstain-Safranin

O Safranin é adicionado para aumentar a visibilidade e o contraste com as bactérias Gram-negativas incolores. A mancha faz com que essas bactérias pareçam rosadas ao microscópio. Como a mancha é adicionada a toda a amostra, ela também mancha bactérias Gram-positivas, mas a mais escura da violeta de cristal esconde a cor rosa mais clara da safranina. Depois que a amostra da lâmina é inundada com safranina por cerca de um minuto, a água é usada para lavar qualquer excesso de mancha que não aderiu às células bacterianas.