Purificação rápida e caracterização de pequenas vesículas extracelulares circulantes em um laboratório em um chip sem rótulo
Layout do dispositivo e esboço gráfico do fluxo experimental. Pequenas vesículas extracelulares (sEVs) foram extraídas simultaneamente de biofluidos humanos usando o dispositivo dieletroforético baseado em isolador (iDEP), em que uma zona de aprisionamento foi criada na região da ponta das micropipetas, equilibrando a força dieletroforética (DEP) com duas forças eletrocinéticas, incluindo eletroosmose (EOF) e eletroforese (EP). Os isolados de sEVs foram caracterizados de forma abrangente usando citometria de fluxo, ImageStreamx e sequenciamento de microRNA (miRNA). Crédito:Relatórios Científicos , doi:10.1038/s41598-023-45409-4 Todas as células secretam vesículas extracelulares em nanoescala naturalmente como partículas delimitadas pela bicamada lipídica. Portanto, são biomarcadores válidos para identificar uma variedade de doenças.
É importante isolar eficientemente pequenas vesículas extracelulares, mantendo o rendimento e a pureza para explorar o seu potencial em aplicações diagnósticas, prognósticas e terapêuticas.
Os métodos convencionais de isolamento apresentam deficiências, que incluem baixa pureza e rendimento, procedimentos de extração demorados, equipamentos especializados e custos elevados.
Em um estudo publicado na Relatórios Científicos , Manju Sharma e uma equipe de cientistas em engenharia biomédica da Universidade de Cincinnati, Ohio, EUA, desenvolveram um novo dispositivo dieletroforético baseado em isolante para isolar rapidamente pequenas vesículas extracelulares de biofluidos e meios de cultura celular, com base em suas propriedades dielétricas.
Os cientistas caracterizaram as pequenas vesículas extracelulares isoladas dos biofluidos de pacientes com câncer usando o instrumento e conduziram uma caracterização tripla com citometria de fluxo convencional, citometria de fluxo de imagem avançada e sequenciamento de microRNA para obter um alto rendimento de vesículas extracelulares puras. A plataforma é eficiente no isolamento rápido de biomarcadores e na manutenção da integridade biomolecular das vesículas.
Vasos biológicos encapsulados em membrana
Biologicamente, pequenas vesículas extracelulares são vasos biológicos encapsulados em membrana encontrados em biofluidos como sangue, urina, saliva, sêmen, leite materno e líquido cefalorraquidiano; liberado pelas células no espaço extracelular.
Essas vesículas em nanoescala podem transferir horizontalmente sua carga biomolecular para funcionar como vetores de sinalização intercelular. Tais vesículas extracelulares proporcionam um elevado grau de sensibilidade e especificidade devido à sua excelente estabilidade. Sua detecção precoce em biópsias líquidas pode melhorar a detecção de cânceres, infecções e doenças neurodegenerativas e metabólicas.
O isolamento das vesículas é, no entanto, um desafio devido ao seu tamanho em nanoescala e propriedades físico-químicas. Os métodos de isolamento normalmente dependem das propriedades das vesículas extracelulares e, embora tais dispositivos tenham atributos promissores, o custo de fabricação, a diluição da amostra e a suscetibilidade ao entupimento são desafios inerentes. (A) FSC-H versus SSC-H da análise de esferas PS-COOH em citometria de fluxo de alta resolução representa a resolução do tamanho das esferas na mistura PS-COOH. (B) Histograma ilustrando diferentes tamanhos de esferas PS-COOH e pequenas vesículas extracelulares derivadas de soro (sEVs). (C) Parcelas representativas de esferas PS-COOH-100 nm fluorescentes-FITC. (D) Representante FSC-H versus SSC-H de sEVs isolados de plasma humano. (E) Representante FSC-H versus SSC-H de sEVs não manchados demonstrando gating. (F) Parcelas representativas como controles negativos i. SEVs corados com isotipo. ii. Anticorpo CD63 em PBS e iii. Anticorpo CD81 em PBS. (G) Gráficos de pontos representativos de sEVs corados para CD63 de i. soro II. plasma e iii. urina. (H) Parcelas representativas de sEVs corados para CD81 de i. soro II. plasma e iii. urina. Crédito:Relatórios Científicos , doi:10.1038/s41598-023-45409-4 Em resposta, Sharma e colegas desenvolveram uma classe de nova abordagem dieletroforética baseada em isolantes com micropilares em canais microfluídicos para engolir rapidamente nanopartículas com base em seu tamanho e propriedades dielétricas exclusivas.
Mecanismo de ação
O dispositivo manteve uma série de micropipetas capazes de isolar nanopartículas de pequenos volumes de amostra, aplicando um campo elétrico significativamente baixo ao longo do comprimento das pipetas. A arquitetura da geometria dos poros permitiu o isolamento de vesículas extracelulares de pequenos volumes de amostras de meios de cultura celular condicionados e biofluidos de doadores saudáveis.
Neste trabalho, Sharma e sua equipe isolaram os biofluidos de pacientes com câncer, que incluíam soro, plasma e urina, seguidos de caracterização multiparamétrica via citometria de fluxo e sequenciamento de miRNA de próxima geração.
(A – C) Tamanho versus SSC de grânulos e grânulos de velocidade de calibração. (D) Tamanho versus FITC ilustrando a localização na dispersão lateral que é positiva para esferas fluorescentes. (E) Gráfico de pontos representativo de FITC vs. intensidade de dispersão (parte superior) e APC vs. intensidade de dispersão (parte inferior). (F) Tamanho representativo vs. gráfico SSC de i. pequenas vesículas extracelulares (sEVs) purificadas de biofluido e controles negativos:ii. PBS iii. anticorpo CD63 iv. anticorpo CD81 e v. Isótipo. (G) Histograma representativo de CD63+ sEVs de i. soro, ii. plasma, iii. urina e controles positivos:iv. sEVs de células-tronco mesenquimais imortalizadas (MSC) hTERT e v. sEVs derivados de carcinoma pulmonar de células não pequenas A549 (NSCLC). (H) Histograma representativo de CD81+ sEVs de i. soro, ii. plasma, iii. urina e controles positivos iv. sEVs MSC imortalizados por hTERT e v. A549 NSCLC sEVs. Crédito:Relatórios Científicos , doi:10.1038/s41598-023-45409-4
Mapa térmico de transcritos de microRNA isolados de pequenas vesículas extracelulares (sEVs) de soro, plasma e urina de pacientes com câncer do trato geniturinário. As colunas representam amostras individuais. A legenda mostra o tipo de biofluido e o local do câncer para cada amostra. As linhas representam transcrições do gene microRNA. A escala de barras coloridas representa o enriquecimento de miRNA. RStudio Desktop (versão 2023.06.2 + 561, acessível em https://posit.co/download/rstudio-desktop/) foi usado para geração de mapa de calor. Crédito:Relatórios Científicos , doi:10.1038/s41598-023-45409-4
A equipe purificou pequenas vesículas extracelulares de soro, plasma e urina em solução salina tamponada com fosfato usando a abordagem dieletroforética baseada em isolante. Sharma e colegas usaram microscopia eletrônica de transmissão para confirmar a presença das vesículas e exploraram a análise multiparamétrica de pequenas vesículas extracelulares circulantes purificadas por meio de citometria de fluxo.
A equipe isolou as vesículas e as analisou, seguidas de estudos convencionais de citometria de fluxo. Os pesquisadores mostraram ainda a capacidade e o uso do dispositivo, caracterizando os isolados por meio do software ImageStream.
Após o sequenciamento do miRNA, a equipe mapeou 137 transcritos distintos e maduros de miRNA para o genoma humano em amostras para incluir o dispositivo em fluxos de trabalho de análise de biomarcadores de miRNA. Eles conduziram perfis transcriptômicos e realizaram análises de componentes principais. Análise de componentes principais centrada em escala de perfis de miRNA exossômico. Amostras agrupadas com base na origem exossômica. O oval tracejado verde destaca amostras extraídas do plasma. O círculo tracejado rosa destaca amostras extraídas do soro. Oval tracejado em azul escuro destaca amostras extraídas da urina. Crédito:Relatórios Científicos , doi:10.1038/s41598-023-45409-4 Perspectiva
Desta forma, Manju Sharma e colegas mostraram a capacidade e eficiência de um dispositivo dieletroforético baseado em isolador de baixa voltagem e sem rótulo para isolar pequenas vesículas extracelulares de soro, plasma e urina de pacientes com câncer por meio de detecção de partículas submicrométricas, e caracterização multiparamétrica usando citometria de fluxo convencional e métodos avançados de citometria de fluxo.
As concentrações de RNA do trabalho foram comparáveis a trabalhos anteriores e afirmaram que o método de isolamento é uma alternativa viável aos já estabelecidos em laboratório. Os métodos analíticos podem ser úteis como plataformas de biópsia líquida para isolar pequenas vesículas extracelulares e desenvolver plataformas de diagnóstico e monitoramento baseadas em vesículas extracelulares.
Mais informações: Manju Sharma et al, Purificação rápida e caracterização multiparamétrica de pequenas vesículas extracelulares circulantes utilizando um dispositivo lab-on-a-chip sem rótulo, Relatórios Científicos (2023). DOI:10.1038/s41598-023-45409-4 Informações do diário: Relatórios Científicos
