Sucessivas molduras de microscópio mostrando o processo de contenção, liberação e translocação de nanopartículas de ouro. a Uma sequência quadro a quadro de captura e liberação de DNA@AuNS, o círculo pontilhado indica a região de captura. b Uma sequência quadro a quadro da translocação de um cluster de DNA@AuNSs presos. A potência do laser é de 0,33 mW, a concentração de AuNS e PEG é de 100 μM e 10% (% em peso), respectivamente. Barra escalonadora = 4 μm. Crédito:Light:Ciência e Aplicações, doi:10.1038/s41377-023-01326-9 As nanopinças optotérmicas são um método inovador de design óptico que revolucionou as técnicas ópticas clássicas para capturar uma ampla gama de nanopartículas. Embora o campo de temperatura optotérmica possa ser empregado para regulação in situ de nanopartículas, permanecem desafios na identificação de seu potencial para regular bionanopartículas.
Para observar os efeitos sinérgicos da manipulação optotérmica e da biodetecção baseada em repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR), os pesquisadores desenvolveram uma combinação de nanopinças optotérmicas alimentadas por CRISPR, abreviadas como CRONT.
Em um novo relatório da Light:Science &Applications , Jiajie Chen e uma equipe de pesquisa em engenharia optoeletrônica, engenharia biomédica e física, conseguiram isso aproveitando a difusioforese e os fluxos termo-osmóticos para a excitação optotérmica, enriquecendo com sucesso nanopartículas de ouro funcionalizadas com DNA, proteínas associadas a CRISPR e filamentos de DNA.
Os cientistas desenvolveram um esquema optotérmico para melhorar a detecção de polimorfismo de nucleotídeo único associado ao CRISPR no nível de molécula única, para introduzir um novo método baseado em CRISPR para observar a clivagem de nucleotídeos. Os pesquisadores estudaram esta abordagem inovadora como um campo universal de diagnóstico no local de atendimento, biofotônica e bionanotecnologia.
Pinças ópticas
Em 1986, Arthur Ashkin inventou pinças ópticas para regular nanoobjetos remotamente e recebeu o prêmio Nobel de física em 2018 por esta descoberta inovadora e contribuição para sistemas biológicos. Embora as pinças ópticas clássicas dependam da transformação do momento da luz, as combinações interdisciplinares entre a óptica plasmônica, o campo elétrico e a temperatura abordaram efetivamente os limites.
Uma variedade de abordagens inovadoras surgiram para oferecer novas oportunidades na análise e regulação de partículas. Nanopinças optotérmicas usam forças termodinâmicas induzidas por óptica para regular nanopartículas em escala de mícron com precisão submícron.
Quando comparadas às pinças ópticas tradicionais, as pinças optotérmicas requerem uma menor densidade de potência, tornando-as uma alternativa atraente para detecção biológica, ao mesmo tempo que reduzem os efeitos ópticos adversos em amostras biológicas. Como os efeitos térmicos desempenham um papel fundamental durante uma variedade de processos biológicos, é possível aproveitar as capacidades do campo de temperatura para aplicações práticas.
O método pode ser usado para regular bionanopartículas que variam de micro a nanoescala para incluir bactérias e células vivas, bem como moléculas e proteínas de DNA de fita simples e dupla. Translocação de um cluster DNA@AuNS. Crédito:Light:Ciência e Aplicações, doi:10.1038/s41377-023-01326-9 Combinando CRISPR com nanopinças — CRONT
O próprio sistema de repetição curta de palíndromo agrupado regularmente interespaçado (CRISPR) oferece uma ferramenta notável de edição de genes, que também recebeu um prêmio Nobel em 2020. O método compreendia uma proteína nuclease associada a CRISPR e um RNA guia específico do DNA alvo.
Os biofísicos e bioengenheiros estão cada vez mais interessados em aumentar a sensibilidade e versatilidade da detecção de DNA, combinando o sistema CRISPR-Cas com novos modos de detecção.
Para superar os limites existentes do método, Chen e colegas projetaram uma plataforma de pinça optotérmica universalmente aplicável, conhecida como nanopinça optotérmica alimentada por CRISPR, para identificar bionanopartículas e usaram a configuração para identificar moléculas de DNA in situ, sem amplificação de ácido nucleico. Os experimentos forneceram volumes de detecção ultrabaixos de 10 μL para identificar polimorfismos de nucleotídeo único para estudar a diversidade genética, a suscetibilidade a doenças e a resposta a medicamentos, para atender às demandas futuras da pesquisa genômica e da medicina.
O princípio de funcionamento
Para habilitar o CRONT (nanotpinça optotérmica alimentada por CRISPR), os cientistas projetaram uma câmara microfluídica com uma fina camada de filme de ouro depositada na tampa de vidro. Quando a equipe irradiou o filme de ouro com iluminação laser, eles geraram um campo de temperatura ao redor do ponto laser. Os cientistas detalharam as condições ideais das reações CRISPR e iniciaram a clivagem do conjugado de nanofilme DNA-ouro, usando microscopia de campo escuro.
Eles adicionaram um polímero não iônico de polietilenoglicol (PEG) à solução aquosa como surfactante biológico para excelente biocompatibilidade.
A presença de múltiplas nanopartículas e sua mobilidade termoforética variável geraram uma concentração distinta de soluto. Quando solutos com concentrações aumentadas influenciaram aqueles com concentrações mais baixas através da pressão osmótica, os resultados resultaram em uma interação conhecida como força difusioforética. Esta investigação sistemática destacou o potencial de inclusão do CRONT para conduzir a identificação biomolecular. Sistema CRONT para detecção e identificação de nucleotídeos. a) Um único DNA@AuNS é capturado pelo CRONT na região de aquecimento do laser. O laser de aquecimento é desligado aos 28,8 segundos e a clivagem é observada posteriormente. b) Medições de rigidez de captura em diferentes potências do laser na direção x/y, com a linha tracejada denotando a rigidez máxima em 0,5 mW. c) Distribuição de posição do DNA@AuNS único preso a 0,5 mW. d) Variação da intensidade da luz de um DNA aprisionado durante a ativação do laser. O ssDNA alvo é parte da sequência do vírus Monkeypox (MP). Os quadros foram registrados usando microscopia de campo escuro e a barra de escala é 2 μm. e) Probabilidade de clivagem do DNA@AuNS em diferentes concentrações alvo de ssDNA (MP). f) Probabilidade de clivagem em diferentes grupos de combinação de crRNA e ssDNA alvo (A-E) para teste de especificidade, as concentrações alvo de ssDNA são 250 fM. g) Probabilidade de clivagem do DNA@AuNS em diferentes concentrações alvo de dsDNA (MP). A potência óptica definida como 0,5 mW em (a), (c – g). h) Probabilidade de clivagem do DNA@AuNS sob dsDNA a uma potência óptica inferior de 0,16 mW, a inserção indica a distribuição de temperatura. Cada evento de captura foi conduzido por 2 minutos e cada ponto de dados compreendeu de 10 a 17 eventos de captura durante um período de 40 minutos. Cada concentração foi testada três vezes. A fração de massa de PEG é de 10%. A concentração de AuNS e Cas12a é 0,5 μM e 0,125 nM respectivamente. Crédito:Light:Ciência e Aplicações, doi:10.1038/s41377-023-01326-9 Combinação optotérmica de proteínas e DNAs
Para habilitar nanopinças optotérmicas alimentadas por CRISPR, Chen e colegas estudaram os comportamentos de agregação de proteínas e DNAs usando marcação de fluorescência onde o comprimento da haste rígida gerou um gradiente de concentração de polietilenoglicol. Embora uma potência de laser mais elevada não tenha aumentado continuamente a taxa de acumulação devido a um fluxo termo-osmótico aumentado, a acumulação de ADN de cadeia simples foi superior à do ADN de cadeia dupla. Embora as acumulações de proteínas sejam raramente estudadas em biofísica, as proteínas Cas12a marcadas com fluorescência mostraram uma tendência a formar ligeiras acumulações semelhantes a anéis, onde o aumento da potência do laser aumentou a sua taxa de acumulação.
A equipe também realizou experimentos com proteínas comumente incorporadas, como a albumina sérica bovina com marcação FITC. Na presença de um campo optotérmico, esta distribuição proteica permaneceu aleatória e não afetada pela presença de moléculas de polietilenoglicol.
Nanopinças optotérmicas alimentadas por CRISPR (CRONT) para identificar nucleotídeos
Chen e sua equipe observaram como o campo optotérmico associado às nanopinças optotérmicas alimentadas por CRISPR (CRONT), forneceu uma temperatura adequada para a biodetecção baseada em CRISPR, com a capacidade de enriquecer bionanopartículas para detectar DNA em concentrações ultrabaixas, em vez do movimento browniano sozinho que é governado através da detecção de difusão.
Os cientistas incluíram o esquema CRISPR-12a para examinar o DNA ambiente de fita simples. O sistema CRONT identificou com sucesso DNAs em nível de molécula única para polimorfismos de nucleotídeo único com alta sensibilidade e especificidade.
Perspectiva
Desta forma, Jiajie Chen e colegas incorporaram difusioforese e fluxos termo-osmóticos na camada limite de um filme responsivo optotérmico para mostrar um novo método para regular nanopinças optotérmicas alimentadas por CRISPR em nanoescala.
Este método permitiu a implementação imediata de biosensor baseado em CRISPR com um volume de detecção ultrabaixo.
As pinças ópticas são dotadas de identificação de DNA por meio de sistemas de biossensor baseados em CRISPR como uma via para o enriquecimento de biomoléculas para clivar o complexo CRISPR. Essas nanopinças optotérmicas alimentadas por CRISPR ou sistemas CRONT representam uma imensa promessa de avançar na compreensão de processos biológicos complexos como uma sonda de detecção versátil em pesquisas biomédicas, descoberta de medicamentos e diagnóstico de doenças.
Mais informações: Jiajie Chen et al, nanopinças optotérmicas alimentadas por CRISPR:manipulação diversificada de bio-nanopartículas e identificação de nucleotídeo único, Light:Science &Applications (2023). DOI:10.1038/s41377-023-01326-9 Informações do diário: Luz:Ciência e Aplicações
