(Phys.org) - O sequenciamento de DNA é a força motriz por trás de descobertas importantes na medicina e na biologia. Por exemplo, a sequência completa do genoma de um indivíduo fornece marcadores e diretrizes importantes para diagnósticos médicos e cuidados de saúde. Até agora, o principal obstáculo tem sido o custo e a velocidade de obtenção de sequências de DNA altamente precisas. Embora vários avanços tenham sido feitos nos últimos 10 anos, a maioria dos instrumentos de sequenciamento de alto rendimento atuais dependem de técnicas ópticas para a detecção dos quatro blocos de construção do DNA:A, C, G e T. Para avançar ainda mais na capacidade de medição, O sequenciamento eletrônico de DNA de um conjunto de modelos de DNA também foi desenvolvido.

Recentemente, foi demonstrado que o DNA pode ser inserido através de poros em nanoescala de proteínas sob uma corrente elétrica aplicada para produzir sinais eletrônicos no nível de uma única molécula. Contudo, porque os quatro nucleotídeos são muito semelhantes em suas estruturas químicas, eles não podem ser facilmente distinguidos usando esta técnica. Assim, a pesquisa e o desenvolvimento de uma plataforma de sequenciamento eletrônico de DNA de uma única molécula é a área de investigação mais ativa e tem o potencial de produzir um sequenciador de DNA portátil capaz de decifrar o genoma para medicina personalizada e pesquisa biomédica básica.

Uma equipe de pesquisadores da Universidade de Columbia, chefiado pelo Dr. Jingyue Ju (o Professor de Engenharia Samuel Ruben-Peter G. Viele, Professor de Engenharia Química e Farmacologia, Diretor do Centro de Tecnologia de Genoma e Engenharia Biomolecular), com colegas do Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia (NIST) liderado pelo Dr. John Kasianowicz (Fellow da American Physical Society), desenvolveram uma nova abordagem para potencialmente sequenciar DNA em nanoporos eletronicamente em nível de molécula única com resolução de base única. Este trabalho, intitulado "PEG-Labeled Nucleotides and Nanopore Detection for Single Molecule DNA Sequencing by Synthesis" está agora disponível no jornal online de acesso aberto, Relatórios Científicos , do grupo Nature Publication.

A estratégia de sequenciação baseada em nanoporos relatada por síntese (Nano-SBS) pode distinguir com precisão quatro bases de DNA, detectando 4 marcadores de tamanhos diferentes liberados de nucleotídeos modificados com 5'-fosfato no nível de molécula única para determinação de sequência. O princípio básico da estratégia Nano-SBS é descrito a seguir. À medida que cada análogo de nucleotídeo é incorporado na fita de DNA em crescimento durante a reação da polimerase, sua etiqueta é liberada pela formação da ligação fosfodiéster. As tags entrarão em um nanopore na ordem de sua liberação, produzindo assinaturas de bloqueio de corrente iônica exclusivas devido às suas estruturas químicas distintas, determinando assim a sequência de DNA eletronicamente em nível de molécula única com resolução de base única. Como prova de princípio, a equipe de pesquisa anexou quatro tags de polímero de comprimento diferente ao fosfato terminal de 2'-desoxiguanosina-5'-tetrafosfato (um bloco de construção de DNA modificado) e demonstrou incorporação eficiente dos análogos de nucleotídeos durante a reação de polimerase, bem como melhor do que a discriminação de linha de base entre as quatro marcas no nível de uma única molécula com base em suas assinaturas de bloqueio de corrente iônica nanopore. Esta abordagem, juntamente com a polimerase ligada aos nanoporos em um formato de matriz, deve render uma plataforma eletrônica Nano-SBS de uma única molécula.

Em trabalhos anteriores, o Centro de Tecnologia de Genoma e Engenharia Biomolecular da Universidade de Columbia, liderado pelo Professor Ju e Dr. Nicholas J. Turro (William P. Schweitzer Professor de Química), desenvolveram um sequenciamento de DNA de quatro cores por plataforma de síntese (SBS) usando terminadores reversíveis de nucleotídeos fluorescentes cliváveis ​​(NRT), que é licenciado para Intelligent Bio-Systems, Inc., uma empresa QIAGEN. SBS com NRTs fluorescentes cliváveis ​​é a abordagem dominante usada nos sistemas de sequenciamento de DNA de próxima geração. O Dr. Kasianowicz e seu grupo no NIST foram os pioneiros na investigação de nanoporos para análise de molécula única. Eles relataram anteriormente que polímeros de diferentes comprimentos, polietilenoglicóis (PEGs), puderam ser distinguidos por seus efeitos únicos nas leituras atuais em nanoporos de proteína α-hemolisina em nível de molécula única e, posteriormente, desenvolveram uma teoria para o método. Seus resultados fornecem a prova de conceito para espectrometria de massa de molécula única. A combinação do conceito de SBS com as marcas eletrônicas detectáveis ​​de nanoporos distintas para rotular blocos de construção de DNA levou ao desenvolvimento da abordagem de Nano-SBS eletrônica de molécula única descrita no atual Relatórios Científicos artigo.

Como o autor principal Dr. Shiv Kumar aponta, "A novidade de nossa abordagem está no design e uso de quatro nucleotídeos marcados de forma diferente, que após incorporação pela DNA polimerase, libere quatro marcas de tamanhos diferentes que se distinguem umas das outras no nível de uma única molécula quando passam pelo nanopore. Esta abordagem supera quaisquer restrições impostas pelas pequenas diferenças entre os quatro nucleotídeos, um desafio que a maioria dos métodos de sequenciamento de nanopore enfrentam há décadas. "Além disso, a técnica é bastante flexível; com tags PEG como protótipos, outras etiquetas químicas podem ser escolhidas para fornecer separação ideal em diferentes sistemas de nanoporos.

Com o desenvolvimento desta abordagem Nano-SBS, como o uso de grandes matrizes de proteínas ou nanoporos sólidos, este sistema tem o potencial de sequenciar com precisão um genoma humano inteiro rapidamente e a baixo custo, permitindo assim que seja usado em diagnósticos médicos de rotina.