A nanoscopia descreve a capacidade de ver além do limite óptico geralmente aceito de 200 a 300 nm. A microscopia de depleção de emissão estimulada (STED), desenvolvida por Stefan W. Hell e Jan Wichmann em 1994, e demonstrada experimentalmente por Hell e Thomas Klar em 1999, é uma técnica de super-resolução para nanoscopia. A microscopia STED fez progressos consideráveis ​​e é amplamente utilizada em pesquisas práticas. Mas seu uso prático envolve algum ruído de fundo indesejável, que afeta negativamente a resolução espacial e a qualidade da imagem. Em geral, esse ruído vem de duas fontes de sinal:(i) fluorescência gerada pela reexcitação causada por doses ultraelevadas de luz do feixe de depleção; e (ii) fluorescência residual, devido ao esgotamento insuficiente do feixe de inibição.
Abordagens significativas de remoção de fundo foram desenvolvidas nas últimas décadas. Estes podem ser divididos em três categorias:domínio do tempo, domínio do espaço e domínio dos fasores. Alguns desses métodos são de longa data e alguns são desenvolvidos mais recentemente. Embora sejam formas poderosas de remover o ruído indesejável das imagens de microscopia STED, todas elas acarretam desvantagens, incluindo distorção da imagem, tempos de aquisição prolongados ou introdução de ruído de disparo. A microscopia STED ainda não atingiu todo o seu potencial.

Conforme relatado em Fotônica avançada , pesquisadores da Universidade de Zhejiang desenvolveram recentemente um novo método chamado STED de "diferença de modulação dupla" (dmdSTED) para suprimir fundos de forma seletiva e eficaz. O método funciona classificando os sinais do domínio do espaço no domínio da frequência, de modo que a fluorescência não esgotada e o fundo induzido por STED sejam convenientemente separados dos sinais fluorescentes desejados. Os feixes de excitação e de depleção são carregados respectivamente com diferentes modulações no domínio do tempo. Como evita a re-excitação causada pelo feixe de depleção, pode-se selecionar um laser de depleção com comprimento de onda mais próximo do pico do espectro de emissão de fluorescência da amostra, reduzindo assim a intensidade de depleção necessária.

A versão atual do dmdSTED funciona com resolução espacial de λ/8, resolução mais alta do que a dos métodos de domínio fasorial (por exemplo, SPLIT, λ/5) que são propensos a ruído de disparo. Teoricamente, a perda de sinal potencial por abordagens no domínio do tempo (como o fechamento do tempo) pode ser evitada por essa abordagem. Além disso, o dmdSTED é compatível com cenários de onda contínua ou pulsada, e não é necessário hardware para contagem de fóton único correlacionada com o tempo (TCSPC). Comparado com os métodos de domínio do espaço, a resolução de tempo do dmdSTED não é limitada. Assim, o dmdSTED é vantajoso na aquisição de imagens de microscopia abrangentes, em resolução espacial, SNR e resolução de tempo.

De acordo com o autor sênior Xu Liu, diretor do State Key Laboratory of Modern Optical Instrumentation, "Este método de domínio de frequência possui grande potencial para integrar outras técnicas de varredura de ponto de feixe duplo, como microscopia de saturação de estado excitado (ESSat), estado de carga microscopia de depleção (CSD), microscopia de depleção do estado fundamental (GSD) e assim por diante. Além disso, pode aceitar mais tipos de amostras com características espectrais diferentes dos corantes fluorescentes comumente usados ​​em STED, como alguns pontos quânticos com um espectro de excitação mais amplo. " + Explorar mais

Supressão de fundo para microscopia de luz de super-resolução