A equipe polonês-israelense da Faculdade de Física da Universidade de Varsóvia e do Instituto de Ciência Weizmann fez outra conquista significativa em microscopia fluorescente. Nas páginas do Optica jornal a equipe apresentou um novo método de microscopia que, em teoria, não tem limite de resolução. Na prática, a equipe conseguiu demonstrar uma melhoria quádrupla em relação ao limite de difração.

O desenvolvimento contínuo das ciências biológicas e da medicina requer a habilidade de examinar objetos cada vez menores. Os cientistas precisam ver a estrutura de, e as relações mútuas entre, por exemplo, proteínas nas células. Ao mesmo tempo, as amostras sendo observadas não devem diferir das estruturas que ocorrem naturalmente em organismos biológicos, que exclui o uso de procedimentos e reagentes agressivos. Embora tenha revolucionado as ciências naturais, o microscópio óptico clássico é claramente insuficiente hoje. Devido à natureza ondulatória da luz, um microscópio óptico não permite estruturas de imagem menores do que cerca de 250 nanômetros. Como resultado, objetos mais próximos uns dos outros do que a metade do comprimento de onda da luz (que é cerca de 250 nm para a luz verde) não podem ser discernidos. Este fenômeno, conhecido como limite de difração, um dos principais obstáculos na observação das menores estruturas biológicas, os cientistas há muito tentam superar. Microscópios eletrônicos fornecem ordens de magnitude melhor resolução, mas só permitem o exame de objetos inanimados, que deve ser colocado no vácuo e bombardeado por um feixe de elétrons. Por esta razão, a microscopia eletrônica não pode ser usada para estudar organismos vivos e os processos naturais que ocorrem neles. É aqui que a microscopia de fluorescência entra em ação, daí o rápido desenvolvimento da microscopia de fluorescência de super-resolução como um campo das ciências físicas e os dois prêmios Nobel já concedidos por pesquisas relacionadas - em 2008 e 2014.

Atualmente várias técnicas de microscopia de fluorescência estão disponíveis, e alguns deles se espalharam em imagens biológicas. Alguns métodos, como PALM, Microscopia STORM ou STED, são caracterizados por uma resolução ultra-alta e permitem discernir objetos localizados a apenas uma dúzia ou mais de nanômetros uns dos outros. Contudo, essas técnicas requerem longos tempos de exposição e um procedimento complexo de preparação de amostras biológicas. Outras técnicas, como microscopia SIM ou ISM, são fáceis de usar, mas oferece uma melhoria de resolução muito limitada, permitindo identificar estruturas com apenas metade do tamanho do limite de difração.

Aleksandra Sroda, Adrian Makowski e Dr. Radek Lapkiewicz do Quantum Optics Lab da Faculdade de Física da Universidade de Varsóvia, em cooperação com o Dr. Ron Tenne, Uri Rossman, Gur Lubin e Prof. Dan Oron do Weizmann Institute of Science em Israel, introduziram uma nova técnica de microscopia de super-resolução, denominado microscopia óptica de flutuação de imagem de super-resolução (SOFISM). No SOFISM, as flutuações que ocorrem naturalmente na intensidade de emissão de marcadores fluorescentes são usadas para aumentar ainda mais a resolução espacial de um microscópio de varredura de imagem (ISM). ISM, um método emergente de super-resolução, já foi implementado em produtos comerciais e provou ser valioso para a comunidade de bioimagem. Largamente, uma vez que atinge uma melhoria modesta na resolução lateral (x2), com muito poucas mudanças na configuração óptica e sem a desvantagem comum de longos tempos de exposição. Assim, ele permite uma extensão natural das capacidades de um microscópio confocal padrão. O ISM usa um microscópio confocal no qual um único detector é substituído por uma matriz de detectores. No SOFISM, as correlações de intensidades detectadas por vários detectores são calculadas. Em princípio, a medição da correlação de ordem n pode levar a um fator de melhoria de resolução de 2n em relação ao limite de difração. Na prática, a resolução alcançável para correlações de ordem superior é limitada pela relação sinal-ruído das medições.

“SOFISM é um compromisso entre facilidade de uso e resolução. Acreditamos que nosso método preencherá o nicho entre o complexo, técnicas difíceis de usar que fornecem resolução muito alta e métodos de baixa resolução fáceis de usar. SOFISM não tem limite de resolução teórica, e em nosso artigo, demonstramos resultados quatro vezes melhores do que o limite de difração. Também mostramos que o método SOFISM tem um alto potencial na geração de imagens de estruturas biológicas tridimensionais, "disse o Dr. Radek Lapkiewicz.

Crucialmente, SOFISM é, em seus aspectos técnicos, altamente acessível, já que requer apenas a introdução de uma pequena modificação no microscópio confocal amplamente usado - substituindo seu tubo fotomultiplicador por um detector de matriz SPAD. Além disso, é necessário aumentar ligeiramente o tempo de medição e alterar o procedimento de processamento de dados. "Até recentemente, Os detectores de matriz SPAD eram caros e suas especificações não eram suficientes para a microscopia baseada em correlação. Esta situação mudou recentemente. Os novos detectores SPAD introduzidos no ano passado removeram as barreiras tecnológicas e de preço. Isso nos faz pensar que as técnicas de microscopia de fluorescência, como SOFISM, podem, em poucos anos, tornou-se amplamente utilizado no campo do exame microscópico, "frisou o Dr. Lapkiewicz.