Cientistas da EPFL desenvolveram imagens de super-resolução multicoloridas robustas e fáceis de implementar. A abordagem é baseada na aquisição simultânea de dois canais espectrais seguida por análise cumulante cruzada espectral e desmistura. Eles exploram a intermitência do fluoróforo e a diafonia espectral para a geração de canais de cores adicionais com imagens super-resolvidas.

A microscopia de fluorescência multicolor é uma ferramenta importante para as ciências da vida no estudo dos arranjos relativos das estruturas celulares ou das interações de diferentes proteínas. Contudo, microscópios convencionais, os burros de carga para muitos estudos biológicos, só pode resolver detalhes na ordem do comprimento de onda da luz. Nas últimas duas décadas, vários conceitos de microscopia de super-resolução ajudaram os pesquisadores a superar esse limite de difração e fazer novas descobertas. Esses novos métodos estão lentamente encontrando seu caminho em aplicações biológicas de rotina. Para algumas das novas técnicas, isso se deve ao complexo hardware do microscópio, mas também o aumento da demanda na preparação de amostras e rótulos fluorescentes representam obstáculos significativos. Os requisitos para imagens de super-resolução bem-sucedidas são ainda mais desafiadores para atender às aplicações multicoloridas.

O Laboratório de Óptica Biomédica da EPFL liderado por Theo Lasser tem trabalhado extensivamente em Imagem de Flutuação Ótica de Super-resolução (SOFI) para aumentar a resolução espacial e amostragem em 2-D e 3-D. SOFI é uma alternativa às técnicas de microscopia de localização de molécula única, como STORM e PALM. Ele analisa estatísticas espaço-temporais de ordem superior de uma série de tempo de fluoróforos piscando e não requer o isolamento das emissões individuais dos fluoróforos. SOFI é compatível com uma ampla gama de condições de rotulagem e imagem, que simplifica a seleção de fluoróforo e experimentos. Em seu novo estudo, pesquisadores da Escola de Engenharia liderada por Theo Lasser e Aleksandra Radenovic (chefe do Laboratório de Biologia em Nanoescala) estendeu a análise estatística para o domínio espectral para preparar o caminho para uma nova abordagem para imagens multicoloridas de super-resolução.

O número de cores não é limitado pelos canais espectrais do microscópio ou explorando a diafonia espectral

A ideia por trás da abordagem SOFI multicolorida é a seguinte. Na imagem multicor clássica, a crosstalk entre os diferentes canais espectrais do microscópio deve ser evitada. Aqui, os pesquisadores exploram o crosstalk para gerar canais de cores adicionais. Eles aplicam a análise cumulativa cruzada entre vários canais espectrais adquiridos simultaneamente. A análise estatística permite que eles complementem os canais físicos de detecção fornecidos pelo microscópio com canais espectrais virtuais adicionais. "Apenas os sinais que estão espacialmente e temporalmente correlacionados nos diferentes canais espectrais aparecerão nos canais virtuais. Estamos captando exatamente o crosstalk do qual todo mundo deseja se livrar." explica Kristin Grußmayer, um dos principais autores do estudo. Os canais espectrais adicionais gerados computacionalmente, juntamente com a unmixing linear, permitem a geração de imagens de cores de fluoróforo mais distintas do que os canais de detecção física registrados.

A publicação fornece a teoria por trás do SOFI multicolorido de cumulante cruzado espectral e inclui uma estrutura para otimizar os canais espectrais do microscópio para uma determinada combinação de fluoróforos que devem ser visualizados. Conjuntos de dados simulados ajudaram a equipe a verificar se sua nova abordagem multicolorida deve funcionar para uma ampla gama de rótulos com diferentes propriedades fotofísicas, mesmo para aqueles com espectros de emissão fortemente sobrepostos. "Nós poderíamos mostrar que nossa abordagem funciona para imagens de três cores em células fixas e vivas para uma variedade de corantes e proteínas fluorescentes. A imagem pode ser realizada usando configurações comerciais de campo amplo com unidades de divisão de imagem de dois canais amplamente disponíveis. Em princípio , não estamos limitados a 3 cores ", diz Kristin Grußmayer.

As instruções para a realização de análise de SOFI de cumulante cruzado espectral multicolorido estão disponíveis na página da Web do Laboratório de Biologia em nanoescala em www.epfl.ch/labs/lben/sofi-packages/ e o pacote de software pode ser baixado em www.epfl.ch/ labs / lben / wp-content / uploads /2020/05/multicolor_sofi_v2.3.zip.