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    Imagem MATRIEX:vendo simultaneamente neurônios em ação em várias regiões do cérebro

    Projeto e implementação de imagens MATRIEX:(a) Diagrama experimental do sistema de imagens MATRIEX. Os dois objetos 3D redondos no canto inferior esquerdo são as vistas superior e inferior da câmara da cabeça do mouse usada para imagens in vivo. (Ti:Sa):Ti:laser pulsante ultrarrápido de safira; PC:célula de Pockels; BE:expansor de feixe; SM1 e SM2:espelhos de varredura x – y; SL:lente de varredura; TL:lente tubular; DM:espelho dicróico; CL:lente de coleta; PMT:tubo fotomultiplicador; DO:objetiva seca; MOs:objetivos miniaturizados. (b) Fotografia mostrando uma visão geral oblíqua do sistema de imagem MATRIEX real. (c) A fotografia na imagem superior mostra uma visão ampliada dos três MOs presos às barras de manipulação sobre a câmara frontal; a fotografia inferior foi tirada diretamente acima dos MOs com uma câmera de smartphone. Todos os MOs usados ​​nesta figura são do mesmo modelo:'versão padrão'. (D, e) Ilustrações da ampliação de dois estágios e acoplamento multiaxis. As imagens quadradas são imagens reais de dois fótons tiradas de contas de 20 μm. Cada círculo vermelho indica um FOV. O modelo de DO utilizado nos painéis (d-f) é o Olympus MPlan × 4 / 0.1, e todos os MOs nesta figura são do mesmo modelo personalizado. (f) Ilustração que mostra a ausência de interferência entre FOVs sob MOs adjacentes. As imagens foram obtidas em uma placa fluorescente uniforme. Os círculos vermelhos indicam as áreas de análise usadas para comparar o contraste da imagem entre duas condições; a condição do lado esquerdo mostra a placa fluorescente em ambos os MOs, e a condição do lado direito mostra a placa de fluorescência sob apenas um MO. (g) Testar a resolução óptica do conjunto do composto com grânulos de 0,51 μm. Curvas:ajustes gaussianos de pontos de dados brutos. Os perfis de intensidade de fluorescência no eixo ou fora do eixo foram medidos quando o eixo do MO estava alinhado com o eixo do DO ou separado do eixo do DO (2 mm para o DO de × 4 ou × 5, 3 mm para o DO de × 2,5, e 4 mm para o DO de × 2), respectivamente. Crédito:Light:Science &Applications, doi:10.1038 / s41377-019-0219-x

    A imagem de microscopia de varredura a laser de dois fótons é comumente aplicada para estudar a atividade neuronal em resoluções celulares e subcelulares em cérebros de mamíferos. Esses estudos ainda estão confinados a uma única região funcional do cérebro. Em um relatório recente, Mengke Yang e colegas do Brain Research Instrument Innovation Center, Instituto de Neurociências, Centro de Neurociência de Sistemas e Tecnologia Avançada de Manufatura de Sistema Ótico na China, A Alemanha e o Reino Unido desenvolveram uma nova técnica chamada explorador multiarea de dois fótons em tempo real in vitro (MATRIEX). O método permitiu ao usuário atingir várias regiões do cérebro funcional com um campo de visão (FOV) de aproximadamente 200 µm de diâmetro para realizar Ca de dois fótons 2+ imagem com resolução de célula única simultaneamente em todas as regiões.

    Yang et al. realizou imagens funcionais em tempo real de atividades de neurônio único no córtex visual primário, córtex motor primário e região CA1 do hipocampo durante os estados anestesiados e de vigília em camundongos. A técnica MATRIEX pode configurar com exclusividade vários FOVs microscópicos usando um único dispositivo de varredura a laser. Como resultado, a técnica pode ser implementada como um módulo óptico adicional dentro da varredura de feixe único convencional existente, microscópios de dois fótons sem modificações adicionais. O MATRIEX pode ser aplicado para explorar a atividade neuronal multiarea in vivo para a função do circuito neural em todo o cérebro com resolução de célula única.

    A microscopia a laser de dois fótons surgiu na década de 1990 para se tornar popular entre os neurocientistas interessados ​​em estudar estruturas e funções neurais in vivo. Uma grande vantagem da imagem de dois e três fótons para cérebros vivos inclui a resolução óptica alcançada em tecidos cerebrais densamente marcados que dispersam fortemente a luz, durante o qual pixels de imagem opticamente seccionados podem ser digitalizados e adquiridos com o mínimo de diafonia. Contudo, as vantagens também causaram desvantagens significativas ao método, impedindo a visão simultânea de dois objetos dentro de uma distância específica. Os pesquisadores já haviam implementado muitas estratégias para estender os limites, mas os métodos eram difíceis de implementar em laboratórios de pesquisa em neurociência. No entanto, existe uma demanda cada vez mais alta na neurociência para investigar as funções neuronais de todo o cérebro com resolução de célula única in vivo.

    ESQUERDA:Diagrama experimental do sistema de imagem MATRIEX. Os dois objetos 3D redondos no canto inferior esquerdo são as vistas superior e inferior da câmara da cabeça do mouse usada para imagens in vivo. (Ti:Sa):Ti:laser pulsante ultrarrápido de safira; PC:célula de Pockels; BE:expansor de feixe; SM1 e SM2:espelhos de varredura x – y; SL:lente de varredura; TL:lente tubular; DM:espelho dicróico; CL:lente de coleta; PMT:tubo fotomultiplicador; DO:objetiva seca; MOs:objetivos miniaturizados. À DIREITA:Ilustrações da ampliação de dois estágios e acoplamento multiaxis. As imagens quadradas são imagens reais de dois fótons tiradas de contas de 20 μm. Cada círculo vermelho indica um FOV. Crédito:Light:Science &Applications, doi:10.1038 / s41377-019-0219-x

    Em uma abordagem direta, os cientistas podem colocar dois microscópios acima do mesmo cérebro animal para obter imagens do córtex e do cerebelo simultaneamente. Mas esses esforços podem levar a aumentos substanciais em complexidade e custo. As altas expectativas existentes para desempenho e viabilidade, portanto, representam uma questão de engenharia altamente desafiadora sobre como um único sistema de imagem pode obter simultaneamente imagens microscópicas ao vivo de várias regiões do cérebro in vivo. Para resolver a questão, Yang et al. introduziu um novo método que combinava ampliação de dois estágios e acoplamento óptico de múltiplos eixos.

    Eles perceberam o método usando uma objetiva seca de baixa ampliação (OD), com vários imersos em água, objetivas miniaturizadas (MOs) sob a objetiva seca. Os cientistas colocaram cada um dos MOs na posição desejada do alvo e profundidade no tecido cerebral. A equipe usou o novo conjunto de objetos compostos de forma semelhante à objetiva original do microscópio imerso em água, sem modificações adicionais no subsistema de digitalização e aquisição de imagens.

    TOPO:Configurando os MOs com parâmetros diferentes para planos de objetos de destino em profundidades diferentes para então serem conjugados no mesmo plano de imagem. Cada cilindro cinza representa uma lente com um valor de pitch, distância de trabalho frontal (L1), distância de trabalho posterior (L2) e comprimento (Z). INFERIOR:Demonstração de imagens MATRIEX:imagens estruturais em várias áreas do cérebro in vivo. a Imagem à esquerda:uma imagem de quadro inteiro incluindo dois FOVs no córtex de associação frontal (FrA) e no cerebelo. Os círculos vermelho e amarelo indicam dois FOVs que são ampliados digitalmente e mostrados nas imagens superior direita e inferior direita. Um camundongo transgênico GAD67-GFP (com os interneurônios marcados em todo o cérebro) foi usado. Dois MOs ('versão padrão') foram colocados na mesma profundidade sob um DO (Mitutoyo × 2 / 0,055). b Exemplo de configuração de três FOVs no córtex de um camundongo transgênico Thy1-GFP (com neurônios corticais da camada 5 especificamente marcados e com dendritos em tufos visíveis perto da superfície cortical). Três MOs ('versão padrão') foram colocados na mesma profundidade sob um DO (Olympus × 4 / 0.1). Crédito:Light:Science &Applications, doi:10.1038 / s41377-019-0219-x

    A equipe de pesquisa primeiro montou o objetivo do composto MATRIEX. Por esta, eles substituíram a objetiva de microscópio de imersão em água convencional por um conjunto de objetiva composto personalizado, dentro de um microscópio de varredura a laser de dois fótons equipado com um dispositivo de varredura raster de feixe único convencional. A montagem do composto continha vários MOs (objetivas miniaturizadas) inseridos por meio de várias craniotomias durante as quais os cientistas colaram uma câmara plástica impressa em 3-D no crânio do modelo do rato. A câmara aproximadamente alinhava os MOs com o mesmo espaço para ajustar a posição lateral e a profundidade. Yang et al. manipulou precisamente os MOs individuais para visualizar os objetos em todos os MOs simultaneamente no mesmo plano de imagem.

    Eles implementaram o método MATRIEX usando dois princípios; ampliação de dois estágios e acoplamento de múltiplos eixos. Por exemplo, usando ampliação de dois estágios com a objetiva seca (DO) sozinha, eles observaram grânulos de 20 µm como pequenos pontos borrados enquanto observavam nítidos, círculos redondos através da montagem composta. Durante o acoplamento multieixo, os cientistas acoplaram um único DO com vários MOs no mesmo plano de imagem. Usando uma varredura simples em uma única moldura retangular, a equipe de pesquisa adquiriu uma imagem retangular contendo vários FOVs circulares (Field of Views) - onde cada FOV correspondia a um MO com interferência mínima de pixel entre FOV.

    Demonstração de imagem MATRIEX:aquisição simultânea de padrões de atividade neuronal ao vivo em V1, M1, e CA1 hipocampal em camundongos no estado anestesiado ou acordado. Os neurônios foram marcados por um indicador fluorescente de Ca2 + geneticamente codificado, GCaMP6f (a) Ilustração que mostra o posicionamento de três MOs sobre o V1, M1 e ​​regiões CA1 do hipocampo em um cérebro de camundongo modelo. (b) Uma fotografia da câmera tirada através da lente ocular do microscópio sob iluminação de campo brilhante de luz branca, em que três FOVs são facilmente visíveis. A região superior é V1, a região inferior esquerda é CA1, e a região inferior direita é M1. (c) Uma imagem de dois fótons, que é uma média de 100 frames, adquirida por varredura raster de quadro inteiro simples com um microscópio de dois fótons. As caixas brancas sólidas mostram as três partes da imagem que são ampliadas no painel (d). (d) FOVs individuais aumentados digitalmente mostrando neurônios em V1, M1, e CA1, de cima para baixo. Barra de escala:40 μm. (e) Traços de sinal de Ca2 + de intervalo de tempo de cinco células de exemplo de cada região, com cada rotulado pelo índice da célula. Registros da mesma célula no mesmo animal no estado anestesiado (lado esquerdo) e no estado acordado (lado direito) são mostrados. (f) Esquerda:traços mostrando eventos de sinal de Ca2 + individuais (divididos a partir de cada tempo de início e sobrepostos) de células de exemplo selecionadas aleatoriamente. Meio:traços de sinal de Ca2 + de cada uma das zonas neuropil que são diretamente adjacentes a cada uma das células de exemplo. À direita:três gráficos de caixa comparando a amplitude do evento do sinal de Ca2 + neuronal com a amplitude do sinal de Ca2 + do neurônio adjacente do neurônio; teste de soma de classificação de Wilcoxon emparelhado, *** P <0,001. (g) Ajuste log-normal dos histogramas de distribuição da amplitude do evento Ca2 + espontâneo para dados reunidos de todos os animais. As barras vermelhas e a curva ajustada mostram a distribuição dos dados registrados no estado de vigília, e as barras azuis e a curva ajustada mostram a distribuição dos dados registrados no estado anestesiado. (h) Correlação de atividade neuronal pareada (coeficientes de correlação de Pearson) para dados reunidos de todos os animais. As barras vermelhas mostram a distribuição dos dados registrados no estado de vigília, e as barras azuis mostram a distribuição dos dados registrados no estado anestesiado. Crédito:Light:Science &Applications, doi:10.1038 / s41377-019-0219-x

    Os cientistas creditaram a ampliação da abertura numérica (NA) por permitir uma melhor resolução com a montagem do composto. As lentes associadas também foram flexíveis e personalizadas para produção em massa a baixo custo para auxiliar no projeto experimental. A principal característica do MATRIEX era sua capacidade de gerar imagens de vários objetos simultaneamente em grandes intervalos de profundidade. Para destacar isso, Yang et al. projetou diferentes MOs com diversos parâmetros, colocando-os em uma profundidade específica onde os planos de objetos correspondentes se conjugam no mesmo eixo. Na prática, a equipe de pesquisa compensou pequenas incompatibilidades entre a profundidade do objeto desejada e a real ajustando os MOs individualmente ao longo de cada um dos eixos z.

    Tipicamente, sob o DO (objetivo seco), o tamanho lateral máximo da zona alvo é limitado pelo tamanho máximo do campo de varredura. Por exemplo, usando um DO com uma ampliação de 2x e zona-alvo de 12 mm de diâmetro, os cientistas podem imaginar o cérebro de um rato adulto inteiro. Neste estudo, Yang et al. fotografou simultaneamente o córtex de associação frontal e o cerebelo do camundongo. Na prática, uma objetiva de ar 4x foi adequada para alcançar melhor resolução para observar estruturas de dendritos finos.

    Imagem simultânea de cálcio no V1, Regiões M1 e CA1 usando MATRIEX durante os estados anestesiado e acordado em camundongos. Veja o filme completo em Credit:Light:Science &Applications, doi:10.1038 / s41377-019-0219-x

    Como prova de princípio, a equipe de pesquisa usou MATRIEX para realizar Ca de dois fótons simultâneos 2+ imagem de neurônios marcados com fluorescência no córtex visual primário (região V1), córtex motor primário (região M1) e região CA1 do hipocampo de camundongos. Na configuração dos três MOs, os cientistas colocaram dois MOs adequados para a região V1 e M1, diretamente acima do córtex e inseriu um MO dentro da região CA1 do hipocampo após a remoção cirúrgica de um tecido cortical. A equipe então projetou as lentes para os planos de objetos correspondentes a V1, M1 e ​​CA1 para conjugação no mesmo plano de imagem. Usando um microscópio de dois fótons equipado com um scanner ressonante de 12 kHz, os cientistas escanearam a imagem completa para observar três FOVs e suas células individuais após ampliar as três seções diferentes para resolver neurônios individuais. Em seguida, eles observaram a potência do laser a ser distribuída entre vários FOVs.

    Enquanto Yang et al. poderia ter obtido esses resultados usando imagens convencionais de FOV único em uma única região do cérebro, a técnica MATRIEX forneceu-lhes dados além daqueles oferecidos com técnicas de imagem de FOV único. Tomados em conjunto, esses resultados permitiram uma distribuição altamente não homogênea e a transformação dos padrões de atividade espontânea do estado anestesiado para o estado de vigília em camundongos, abrangendo um nível de circuito de todo o cérebro com resolução de célula única.

    Desta maneira, Menge Yang e colegas de trabalho desenvolveram a técnica MATRIEX com base no princípio de ampliação de dois estágios e acoplamento óptico de múltiplos eixos. Eles conduziram simultaneamente Ca de dois fótons 2+ imagiologia em atividades de população neuronal em diferentes profundidades em diversas regiões (V1, M1 e ​​CA1) em camundongos anestesiados e acordados com resolução de célula única. Mais importante, qualquer microscópio convencional de dois fótons pode ser transformado em um microscópio MATRIEX, preservando todas as funcionalidades originais. A chave para a transformação é baseada no projeto de uma montagem objetiva composta. Os pesquisadores podem usar diferentes, MOs cuidadosamente projetados para atender a diversas regiões do cérebro com 100 por cento de compatibilidade entre a técnica MATRIEX e a microscopia convencional. A equipe de pesquisa espera que a técnica MATRIEX avance substancialmente em três dimensões, dinâmica do circuito neural de todo o cérebro em resolução de célula única.

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