A imagem de microscopia de varredura a laser de dois fótons é comumente aplicada para estudar a atividade neuronal em resoluções celulares e subcelulares em cérebros de mamíferos. Esses estudos ainda estão confinados a uma única região funcional do cérebro. Em um relatório recente, Mengke Yang e colegas do Brain Research Instrument Innovation Center, Instituto de Neurociências, Centro de Neurociência de Sistemas e Tecnologia Avançada de Manufatura de Sistema Ótico na China, A Alemanha e o Reino Unido desenvolveram uma nova técnica chamada explorador multiarea de dois fótons em tempo real in vitro (MATRIEX). O método permitiu ao usuário atingir várias regiões do cérebro funcional com um campo de visão (FOV) de aproximadamente 200 µm de diâmetro para realizar Ca de dois fótons ²⁺ imagem com resolução de célula única simultaneamente em todas as regiões.

Yang et al. realizou imagens funcionais em tempo real de atividades de neurônio único no córtex visual primário, córtex motor primário e região CA1 do hipocampo durante os estados anestesiados e de vigília em camundongos. A técnica MATRIEX pode configurar com exclusividade vários FOVs microscópicos usando um único dispositivo de varredura a laser. Como resultado, a técnica pode ser implementada como um módulo óptico adicional dentro da varredura de feixe único convencional existente, microscópios de dois fótons sem modificações adicionais. O MATRIEX pode ser aplicado para explorar a atividade neuronal multiarea in vivo para a função do circuito neural em todo o cérebro com resolução de célula única.

A microscopia a laser de dois fótons surgiu na década de 1990 para se tornar popular entre os neurocientistas interessados ​​em estudar estruturas e funções neurais in vivo. Uma grande vantagem da imagem de dois e três fótons para cérebros vivos inclui a resolução óptica alcançada em tecidos cerebrais densamente marcados que dispersam fortemente a luz, durante o qual pixels de imagem opticamente seccionados podem ser digitalizados e adquiridos com o mínimo de diafonia. Contudo, as vantagens também causaram desvantagens significativas ao método, impedindo a visão simultânea de dois objetos dentro de uma distância específica. Os pesquisadores já haviam implementado muitas estratégias para estender os limites, mas os métodos eram difíceis de implementar em laboratórios de pesquisa em neurociência. No entanto, existe uma demanda cada vez mais alta na neurociência para investigar as funções neuronais de todo o cérebro com resolução de célula única in vivo.

Em uma abordagem direta, os cientistas podem colocar dois microscópios acima do mesmo cérebro animal para obter imagens do córtex e do cerebelo simultaneamente. Mas esses esforços podem levar a aumentos substanciais em complexidade e custo. As altas expectativas existentes para desempenho e viabilidade, portanto, representam uma questão de engenharia altamente desafiadora sobre como um único sistema de imagem pode obter simultaneamente imagens microscópicas ao vivo de várias regiões do cérebro in vivo. Para resolver a questão, Yang et al. introduziu um novo método que combinava ampliação de dois estágios e acoplamento óptico de múltiplos eixos.

Eles perceberam o método usando uma objetiva seca de baixa ampliação (OD), com vários imersos em água, objetivas miniaturizadas (MOs) sob a objetiva seca. Os cientistas colocaram cada um dos MOs na posição desejada do alvo e profundidade no tecido cerebral. A equipe usou o novo conjunto de objetos compostos de forma semelhante à objetiva original do microscópio imerso em água, sem modificações adicionais no subsistema de digitalização e aquisição de imagens.

A equipe de pesquisa primeiro montou o objetivo do composto MATRIEX. Por esta, eles substituíram a objetiva de microscópio de imersão em água convencional por um conjunto de objetiva composto personalizado, dentro de um microscópio de varredura a laser de dois fótons equipado com um dispositivo de varredura raster de feixe único convencional. A montagem do composto continha vários MOs (objetivas miniaturizadas) inseridos por meio de várias craniotomias durante as quais os cientistas colaram uma câmara plástica impressa em 3-D no crânio do modelo do rato. A câmara aproximadamente alinhava os MOs com o mesmo espaço para ajustar a posição lateral e a profundidade. Yang et al. manipulou precisamente os MOs individuais para visualizar os objetos em todos os MOs simultaneamente no mesmo plano de imagem.

Eles implementaram o método MATRIEX usando dois princípios; ampliação de dois estágios e acoplamento de múltiplos eixos. Por exemplo, usando ampliação de dois estágios com a objetiva seca (DO) sozinha, eles observaram grânulos de 20 µm como pequenos pontos borrados enquanto observavam nítidos, círculos redondos através da montagem composta. Durante o acoplamento multieixo, os cientistas acoplaram um único DO com vários MOs no mesmo plano de imagem. Usando uma varredura simples em uma única moldura retangular, a equipe de pesquisa adquiriu uma imagem retangular contendo vários FOVs circulares (Field of Views) - onde cada FOV correspondia a um MO com interferência mínima de pixel entre FOV.

Os cientistas creditaram a ampliação da abertura numérica (NA) por permitir uma melhor resolução com a montagem do composto. As lentes associadas também foram flexíveis e personalizadas para produção em massa a baixo custo para auxiliar no projeto experimental. A principal característica do MATRIEX era sua capacidade de gerar imagens de vários objetos simultaneamente em grandes intervalos de profundidade. Para destacar isso, Yang et al. projetou diferentes MOs com diversos parâmetros, colocando-os em uma profundidade específica onde os planos de objetos correspondentes se conjugam no mesmo eixo. Na prática, a equipe de pesquisa compensou pequenas incompatibilidades entre a profundidade do objeto desejada e a real ajustando os MOs individualmente ao longo de cada um dos eixos z.

Tipicamente, sob o DO (objetivo seco), o tamanho lateral máximo da zona alvo é limitado pelo tamanho máximo do campo de varredura. Por exemplo, usando um DO com uma ampliação de 2x e zona-alvo de 12 mm de diâmetro, os cientistas podem imaginar o cérebro de um rato adulto inteiro. Neste estudo, Yang et al. fotografou simultaneamente o córtex de associação frontal e o cerebelo do camundongo. Na prática, uma objetiva de ar 4x foi adequada para alcançar melhor resolução para observar estruturas de dendritos finos.

Como prova de princípio, a equipe de pesquisa usou MATRIEX para realizar Ca de dois fótons simultâneos ²⁺ imagem de neurônios marcados com fluorescência no córtex visual primário (região V1), córtex motor primário (região M1) e região CA1 do hipocampo de camundongos. Na configuração dos três MOs, os cientistas colocaram dois MOs adequados para a região V1 e M1, diretamente acima do córtex e inseriu um MO dentro da região CA1 do hipocampo após a remoção cirúrgica de um tecido cortical. A equipe então projetou as lentes para os planos de objetos correspondentes a V1, M1 e ​​CA1 para conjugação no mesmo plano de imagem. Usando um microscópio de dois fótons equipado com um scanner ressonante de 12 kHz, os cientistas escanearam a imagem completa para observar três FOVs e suas células individuais após ampliar as três seções diferentes para resolver neurônios individuais. Em seguida, eles observaram a potência do laser a ser distribuída entre vários FOVs.

Enquanto Yang et al. poderia ter obtido esses resultados usando imagens convencionais de FOV único em uma única região do cérebro, a técnica MATRIEX forneceu-lhes dados além daqueles oferecidos com técnicas de imagem de FOV único. Tomados em conjunto, esses resultados permitiram uma distribuição altamente não homogênea e a transformação dos padrões de atividade espontânea do estado anestesiado para o estado de vigília em camundongos, abrangendo um nível de circuito de todo o cérebro com resolução de célula única.

Desta maneira, Menge Yang e colegas de trabalho desenvolveram a técnica MATRIEX com base no princípio de ampliação de dois estágios e acoplamento óptico de múltiplos eixos. Eles conduziram simultaneamente Ca de dois fótons ²⁺ imagiologia em atividades de população neuronal em diferentes profundidades em diversas regiões (V1, M1 e ​​CA1) em camundongos anestesiados e acordados com resolução de célula única. Mais importante, qualquer microscópio convencional de dois fótons pode ser transformado em um microscópio MATRIEX, preservando todas as funcionalidades originais. A chave para a transformação é baseada no projeto de uma montagem objetiva composta. Os pesquisadores podem usar diferentes, MOs cuidadosamente projetados para atender a diversas regiões do cérebro com 100 por cento de compatibilidade entre a técnica MATRIEX e a microscopia convencional. A equipe de pesquisa espera que a técnica MATRIEX avance substancialmente em três dimensões, dinâmica do circuito neural de todo o cérebro em resolução de célula única.

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