p A capacidade de transformar a luz do sol em energia é um dos feitos mais notáveis ​​da Natureza. Os cientistas entendem o processo básico da fotossíntese, mas muitos detalhes cruciais permanecem ilusórios, ocorrendo em dimensões e escalas de tempo fugazes por muito tempo consideradas minúsculas demais para serem investigadas. p Agora, isso está mudando.

p Em um novo estudo, liderado por Petra Fromme e Nadia Zatsepin no Biodesign Center for Applied Structural Discovery, a Escola de Ciências Moleculares e o Departamento de Física da ASU, pesquisadores investigaram a estrutura do fotossistema I (PSI) com pulsos de raios-X ultracurtos no laser europeu de elétrons de raios-X (EuXFEL), localizado em Hamburgo, Alemanha.

p PSI é um grande sistema biomolecular que atua como um conversor de energia solar, transformando a energia solar em energia química. A fotossíntese fornece energia para todas as formas de vida complexas na Terra e fornece o oxigênio que respiramos. Os avanços em desvendar os segredos da fotossíntese prometem melhorar a agricultura e ajudar no desenvolvimento de sistemas de armazenamento de energia solar de próxima geração que combinam a eficiência da Natureza com a estabilidade dos sistemas de engenharia humana.

p "Este trabalho é tão importante, pois mostra a primeira prova de conceito de cristalografia serial megahertz com uma das maiores e mais complexas proteínas de membrana na fotossíntese:Fotossistema I ", diz Fromme." O trabalho abre caminho para estudos resolvidos no tempo no EuXFEL para determinar filmes moleculares de o caminho impulsionado pela luz dos elétrons na fotossíntese ou visualizar como as drogas contra o câncer atacam as proteínas com mau funcionamento. "

p O EuXFEL, que recentemente começou a operar, é o primeiro a empregar um acelerador linear supercondutor que produz novos recursos interessantes, incluindo taxas de repetição de megahertz muito rápidas de seus pulsos de raios-X - mais de 9.000 vezes mais rápido do que qualquer outro XFEL - com pulsos separados por menos de 1 milionésimo de segundo. Com essas explosões incrivelmente breves de luz de raios-X, os pesquisadores serão capazes de gravar muito mais rapidamente filmes moleculares de processos biológicos fundamentais e provavelmente terão impacto em diversos campos, incluindo medicina e farmacologia, química, física, Ciência de materiais, pesquisa de energia, estudos ambientais, eletrônicos, nanotecnologia, e fotônica. Petra Fromme e Nadia Zatsepin são co-autoras do artigo, publicado na atual edição da revista Nature Communications .

p Força em números

p Fromme é o diretor do Centro de Biodesign para Descoberta Estrutural Aplicada (CASD) e lidera os esforços da equipe experimental do projeto, enquanto Zatsepin liderava a equipe de análise de dados XFEL.

p "Este é um marco significativo no desenvolvimento da cristalografia serial de femtossegundo, com base no esforço bem coordenado de um grande, interdisciplinar, equipe internacional e anos de desenvolvimento em campos díspares "enfatiza Zatsepin, ex-Professor Assistente de Pesquisa no Departamento de Física e Biodesign da ASU CASD, e agora pesquisador sênior da La Trobe University, na Austrália.

p Christopher Gisriel, o co-primeiro autor do artigo, trabalhou no projeto enquanto pesquisador de pós-doutorado no laboratório Fromme e está animado com o projeto. "A coleta rápida de dados em experimentos de cristalografia de femtossegundos em série torna esta técnica revolucionária mais acessível para aqueles interessados ​​na relação estrutura-função para enzimas. Isso é exemplificado por nossa nova publicação em Nature Communications mostrando que mesmo as estruturas protéicas mais difíceis e complexas podem ser resolvidas por cristalografia serial de femtossegundo durante a coleta de dados na taxa de repetição de megahertz. "

p "É muito emocionante ver o trabalho árduo de muitas pessoas que levaram este projeto a se materializar, "diz Jesse Coe, co-primeiro autor que se formou no ano passado com um Ph.D. em Bioquímica pela ASU. "Este é um grande passo na direção certa para entender melhor o processo de transferência de elétrons da Natureza, que foi refinado ao longo de bilhões de anos."

p Ciência extrema

p Um XFEL (para laser de elétrons livres de raios-X) fornece luz de raios-X um bilhão de vezes mais brilhante do que as fontes convencionais de raios-X. O brilhante, pulsos de raios-X semelhantes a laser são produzidos por elétrons acelerados até perto da velocidade da luz e alimentados através da lacuna entre séries de ímãs alternados, um dispositivo conhecido como ondulador. O ondulador força os elétrons a balançarem e se agruparem em pacotes discretos. Cada um dos feixes de elétrons oscilantes perfeitamente sincronizados emite um poderoso, pulso de raio-X breve ao longo da trajetória de vôo do elétron.

p Na cristalografia serial de femtossegundo, um jato de cristais de proteína é injetado no caminho do feixe XFEL pulsado em temperatura ambiente, produzindo informações estruturais na forma de padrões de difração. A partir desses padrões, os cientistas podem determinar imagens em escala atômica de proteínas em condições próximas às nativas, pavimentando o caminho para filmes moleculares precisos de moléculas em ação.

p Os raios X danificam as biomoléculas, um problema que tem atormentado os esforços de determinação de estrutura por décadas, exigindo que as biomoléculas sejam congeladas para limitar o dano. Mas as rajadas de raios-X produzidas por um XFEL são tão curtas - durando meros femtossegundos - que o espalhamento de raios-X de uma molécula pode ser registrado antes que a destruição ocorra, semelhante a usar um obturador de câmera rápido. Como ponto de referência, um femtossegundo é um milionésimo de um bilionésimo de um segundo, a mesma proporção de um segundo é para 32 milhões de anos.

p Devido à sofisticação, tamanho e custo das instalações XFEL, apenas cinco estão disponíveis atualmente para tais experimentos em todo o mundo - um grande gargalo para os pesquisadores, uma vez que cada XFEL pode hospedar apenas um experimento por vez. A maioria dos XFELs gera pulsos de raios-X entre 30 e 120 vezes por segundo e pode levar várias horas a dias para coletar os dados necessários para determinar uma única estrutura, muito menos uma série de frames em um filme molecular. O EuXFEL é o primeiro a empregar um acelerador linear supercondutor em seu projeto, permitindo a sucessão mais rápida de pulsos de raios-X de qualquer XFEL, o que pode reduzir significativamente o tempo necessário para determinar cada estrutura ou quadro do filme.

p Alto risco, alta recompensa

p Como a amostra é obliterada pelos intensos pulsos de raios-X, deve ser reabastecido a tempo para o próximo pulso de raios-X, que exigia que os cristais PSI fossem entregues 9000 vezes mais rápido no EuXFEL do que nos XFELs anteriores - a uma velocidade de jato de cerca de 50 metros por segundo (160 pés por segundo), como uma mangueira de incêndio microfluídica. Isso foi desafiador, pois requer grandes quantidades da preciosa proteína contida em cristais uniformes para atingir essas altas velocidades de jato e evitar o bloqueio do sistema de entrega da amostra. Grandes proteínas de membrana são tão difíceis de isolar, cristalizar e entregar ao feixe, que não se sabia se esta importante classe de proteínas poderia ser estudada no EuXFEL.

p A equipe desenvolveu novos métodos que permitiram PSI, que é um grande complexo que consiste em 36 proteínas e 381 cofatores, que incluem as 288 clorofilas (os pigmentos verdes que absorvem a luz) e tem mais de 150, 000 átomos e é mais de 20 vezes maior do que as proteínas anteriores estudadas no EuXFEL, ter sua estrutura determinada em temperatura ambiente com uma resolução notável de 2,9 angstrom - um marco significativo.

p Bilhões de microcristais da proteína de membrana PSI, derivado de cianobactérias, teve que ser cultivado para o novo estudo. O rápido crescimento do cristal a partir de sementes de nanocristais foi necessário para garantir a uniformidade essencial do tamanho e forma do cristal. PSI é uma proteína de membrana, que é uma classe de proteínas de alta importância cuja caracterização é notoriamente complicada. Suas estruturas elaboradas estão embutidas na bicamada lipídica da membrana celular. Tipicamente, eles devem ser cuidadosamente isolados de forma totalmente ativa de seu ambiente nativo e transformados em um estado cristalino, onde as moléculas se agrupam em cristais, mas mantêm todas as suas funções nativas.

p No caso do PSI, isso é obtido pela extração com detergentes muito suaves que substituem a membrana e envolvem a proteína como um tubo interno de piscina, que imita o ambiente de membrana nativa e mantém o PSI totalmente funcional, uma vez que é embalado dentro dos cristais. Então, quando os pesquisadores iluminam os pigmentos verdes (clorofilas) que captam a luz pelo sistema de antena do PSI, a energia é usada para disparar um elétron através da membrana.

p Para manter o PSI totalmente funcional, os cristais são fracamente empacotados contendo 78% de água, o que os torna macios como um pedaço de manteiga ao sol e torna difícil o manuseio desses cristais frágeis. "Isolar, caracterizar e cristalizar um grama de PSI, ou um bilhão de bilhões de moléculas PSI, pois os experimentos em sua forma totalmente ativa foi um grande esforço dos alunos e pesquisadores de minha equipe ", diz Fromme." No futuro, com taxas de repetição ainda mais altas e novos sistemas de entrega de amostra, o consumo de amostra será drasticamente reduzido. "

p O registro e análise dos dados de difração foi outro desafio. Um detector de raios-X exclusivo foi desenvolvido pelo EuXFEL e DESY para lidar com as demandas de estudos de biologia estrutural no EuXFEL:o detector de pixel de integração de ganho adaptativo, ou AGIPD. Cada um dos 1 milhão de pixels do AGIPD tem menos de um centésimo de polegada de diâmetro e contém 352 células de memória analógica, que permitem ao AGIPD coletar dados em taxas de megahertz em uma ampla faixa dinâmica. Contudo, coletar dados cristalográficos precisos de microcristais de grandes proteínas de membrana exigia um compromisso entre a resolução espacial e a amostragem dos dados.

p "Pressionar para uma coleta de dados de resolução mais alta com o tamanho do detector atual pode impedir o processamento útil dos dados cristalográficos porque os pontos de difração são insuficientemente resolvidos pelos pixels do detector de raios-X" avisa Zatsepin, "ainda em termos de taxas de dados e faixa dinâmica, o que o AGIPD é capaz de fazer é incrível. "

p O novo software de redução de dados e análise cristalográfica projetado especificamente para lidar com os desafios exclusivos dos enormes conjuntos de dados na cristalografia XFEL, cujo desenvolvimento foi liderado por colaboradores do CFEL, DESY, e ASU, percorreram um longo caminho desde o primeiro experimento XFEL de alta resolução em 2011.

p "Nosso software e as capacidades de computação de alto desempenho do DESY estão realmente sendo colocados à prova com os volumes de dados sem precedentes gerados no EuXFEL. É sempre emocionante ultrapassar os limites da tecnologia de ponta, "adiciona Zatsepin.

p Proteínas de membrana:disquete, ainda formidável

p Proteínas de membrana como PSI - nomeadas porque estão incorporadas nas membranas celulares - são vitais para todos os processos vitais, incluindo a respiração, função nervosa, absorção nutricional, e sinalização célula-célula. Como estão na superfície de cada célula, são também os alvos mais importantes dos fármacos. Mais de 60% de todos os medicamentos atuais são direcionados às proteínas de membrana. O projeto de drogas mais eficazes com menos efeitos colaterais depende, portanto, da compreensão de como drogas específicas se ligam a suas proteínas-alvo e suas conformações estruturais e atividades dinâmicas altamente detalhadas.

p Apesar de sua enorme importância na biologia, estruturas de proteínas de membrana representam menos de 1% de todas as estruturas de proteínas resolvidas até o momento porque são notoriamente difíceis de isolar, caracterizar e cristalizar. É por isso que grandes avanços nos métodos cristalográficos, como o advento da cristalografia serial de femtossegundo de proteína de membrana megahertz, sem dúvida, terão um impacto significativo na comunidade científica.

p Leva uma aldeia

p Essas conquistas recentes não seriam possíveis sem o esforço incansável de uma equipe dedicada de quase 80 pesquisadores de 15 instituições, incluindo ASU, o XFEL europeu, DESY, o Center for Ultrafast X-ray Science, Instituto Hauptman-Woodward, SUNY Buffalo, SLAC, Universidade de Hamburgo, Universidade de Goettingen, Academia Húngara de Ciências, Universidade do Tennessee, Laboratório Nacional Lawrence Livermore, Universidade de Southampton, Universidade de Tecnologia de Hamburgo, University of Wisconsin. O grupo de pesquisa incluiu colaboradores dos EUA no Centro de Ciência e Tecnologia NSF BioXFEL e um grupo de colaboradores internacionais, incluindo Adrian P. Mancuso e Romain Letrun, cientistas líderes da linha de luz EuXFEL e Oleksandr Yefanov e Anton Barty do CFEL / DESY, que trabalharam em estreita colaboração com a equipe da ASU na análise de dados complexos.