Configuração de NMR de pré-polarização microfluídica. (A) Comparação da polarização estatística e térmica de prótons na água em função do volume de detecção. A densidade de prótons da água à temperatura ambiente é ρ =6,7 × 1028 m − 3. (B) Conceito de pré-polarização. O analito é pré-polarizado fluindo-o através de um ímã permanente (matriz 1.5-T Halbach). Ele é posteriormente transportado para um chip microfluídico alojado em um campo magnético inferior (B0 =13 mT, Bobinas de Helmholtz) onde é detectado por NV NMR. (C) Configuração de detecção. O analito pré-polarizado flui para um chip microfluídico onde é interrompido por meio de interruptores fluídicos (não mostrado), e o sinal NV NMR é detectado usando um microscópio de epifluorescência customizado com uma abertura numérica (NA) de ∼0,8. Um conjunto de oito bobinas de compensação de gradiente é usado para eliminar gradientes de campo magnético de primeira e segunda ordem ao longo da direção do campo. O campo é estabilizado temporariamente usando um magnetômetro NMR baseado em bobina em combinação com bobinas de feedback de baixa indutância enroladas em torno das bobinas Helmholtz principais. (D) Configuração de chip microfluídico. O chip é construído com vidro e adesivos. Duas linhas fluídicas passam para a região de detecção, um consistindo de água (para magnetômetro de bobina de NMR) e o outro com analito (para NV NMR). Um loop de excitação de radiofrequência (RF), colocado entre o magnetômetro de bobina de NMR e o sensor NV NMR, excita a coerência do spin nuclear em ambos os canais. O magnetômetro de bobina de NMR consiste em uma bobina de 3 mm de diâmetro enrolada em torno de um volume de água de ∼10 μl. O circuito de excitação de RF e o magnetômetro de bobina de NMR foram colocados ortogonalmente um ao outro para minimizar a interferência. Linhas de microondas de cobre (MW), impresso no interior do chip de vidro, fornece controle de spin sobre os spins do elétron NV. (E) Geometria NV NMR. Uma membrana de diamante dopada com NV (1 mm por 1 mm por 0,035 mm) está localizada na superfície de um canal microfluídico (largura:2 mm, altura:entre 0,2 mm e 1 mm) em contato com o analito. A iluminação a laser (532 nm) reflete na linha de microondas impressa, e a fluorescência (650 a 800 nm) é detectada. O volume de detecção de analito eficaz é de ~ 40 pL. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aaw7895
Sensores quânticos baseados em centros de vacância de nitrogênio (NV) em diamante são um modo de detecção promissor para espectroscopia de ressonância magnética nuclear devido ao seu volume de detecção em escala de mícron e requisitos de detecção de amostra não indutiva. Um desafio que existe é realizar suficientemente alta resolução espectral juntamente com sensibilidade de concentração para análise de NMR multidimensional de volumes de amostra de picolitro. Em um novo relatório agora em Avanços da Ciência , Janis Smits e uma equipe de pesquisa interdisciplinar nos departamentos de Materiais de Alta Tecnologia, A Física e a Astronomia nos EUA e na Letônia abordaram o desafio separando espacialmente as fases de polarização e detecção do experimento em uma plataforma microfluídica.
Eles perceberam uma resolução espectral de 0,65 ± 0,05 Hz, uma melhoria de ordem de magnitude em comparação com estudos anteriores de NMR de diamante. Usando a plataforma, eles realizaram espectroscopia de correlação 2-D de analitos líquidos com um volume de detecção eficaz de ~ 40 picolitros. A equipe de pesquisa usou sensores quânticos de diamante como detectores de RMN microfluídicos em linha em um grande passo à frente para aplicações em análise química de massa limitada e biologia de célula única.
A espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) é uma técnica poderosa e bem estabelecida para composição, análise estrutural e funcional em uma variedade de disciplinas científicas. Na espectrometria de NMR convencional, a relação sinal-ruído (SNR) é fortemente dependente da intensidade do campo externo (B 0 ) Conforme a resolução espectral aumentou, o B 0 aumentou também, motivando o desenvolvimento de ímãs supercondutores cada vez maiores e caros para melhorar a resolução e SNR, resultando em um aumento de duas vezes na intensidade do campo nos últimos 25 anos.
Contudo, mesmo com B grande 0 valores, a detecção de volumes em microescala muitas vezes exigia marcação isotópica, amostras concentradas e longos cronogramas experimentais. Para melhorar a sensibilidade para pequenos volumes de amostra, pesquisadores desenvolveram bobinas indutivas em miniatura, que permitiu vários avanços, incluindo espectroscopia de óvulos e diagnósticos in vitro. Os limites de sensibilidade e detecção existentes ainda são subótimos para análise metabólica de células de mamíferos individuais ou para inclusão em ensaios microfluídicos em linha. Como uma estratégia alternativa de detecção de NMR, Sensores quânticos baseados em centros de vacância de nitrogênio (NV) em diamante surgiram devido à sua resolução espacial submicrométrica e detecção baseada em não indutiva.
Amplitude de projeção do campo magnético AC nuclear (integrado ao volume do sensor) em função do volume de água. O volume de detecção efetivo (∼40 pL) é definido como o volume em que a amplitude de projeção do campo CA nuclear é igual à metade do volume total da amostra efetiva. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aaw7895
Os cientistas já implementaram o método para detectar flutuações iniciais em nanoescala de magnetização nuclear para aumentar a polarização. Eles usaram solventes viscosos para melhorar a resolução de frequência para ~ 100 Hz para obter a resolução de grandes mudanças químicas em B 0 =3 T (Tesla). Embora outras melhorias na resolução possam ser feitas aumentando o volume de detecção (V), eles representavam um custo para a SNR. No presente trabalho, Smits et al. relatam uma melhoria de ordem de magnitude na resolução espectral para realizar uma sensibilidade de concentração de ~ 27 M s 1/2 . Para alcançar isto, eles separaram espacialmente as fases de polarização e detecção do experimento em uma configuração microfluídica.
A equipe de pesquisa usou ímãs permanentes fortes (1,5 Tesla) para gerar polarização de spin nuclear e realizou a detecção em 13 mT usando bobinas de Helmholtz para simplificar a tarefa de estabilizar larguras de linha de NMR em níveis sub-hertz. Eles facilitaram o uso de sensores quânticos de diamante como detectores de NMR microfluídicos em linha em baixas frequências de micro-ondas. As melhorias permitiram Smits et al. para realizar espectroscopia de correlação bidimensional (2-D) (COSY) de analitos líquidos dentro de um volume de detecção eficaz de ~ 40 pL (pico-litros). Os pesquisadores pretendem combinar esta plataforma com avanços na polarização nuclear dinâmica usando agentes de polarização externos e, potencialmente, hiperpolarização óptica com centros NV para permitir espectroscopia de NMR de metabólitos em concentrações fisiológicas em resolução espacial de célula única.
Na configuração experimental, Smits et al. alojou os analitos de fluido em um recipiente pressurizado de hélio com taxas de fluxo variáveis de até 50 µl / s. O tempo de permanência para os analitos aproximou-se de 6s, mais longo do que o tempo de relaxamento de spin dos analitos estudados (por exemplo T 1 para água ≈ 3s) levando a uma polarização de equilíbrio de ~ 5x10 -6 . O analito então fluiu para uma região de detecção para identificação por NV NMR. Para conduzir a detecção de NV NMR, os cientistas usaram um microscópio de epifluorescência customizado e membranas de diamante orientadas fabricadas no estudo, em quatro eixos NV possíveis para alinhar com o campo magnético na configuração.
Caracterização de NMR NV pré-polarizado. (A) A seqüência de pulso de leitura sincronizada. Ele consiste em um trem de pulsos XY8-N que realizam medições de fase sucessivas do campo magnético CA produzido pelos núcleos de processamento. A fluorescência medida reflete uma versão com alias da projeção do campo CA nuclear. A sequência inteira é repetida a cada 2,5 a 4,25 s (1,25 s para fluxo e o restante para detecção). (B) espectros de NMR NV (valor absoluto da transformada de Fourier) de água (vermelho) e um campo de teste de amplitude 2,5-nT aplicado (azul) para um tempo de aquisição efetivo de 5,2 s (média de 60 traços; tempo de medição total, 150 s). A amplitude do sinal de NMR obtida do sinal fotodetector processado é registrada em μV. A conversão para a amplitude do campo magnético (em nT) é derivada do campo de teste calibrado. Detalhe:O DP do piso de ruído revela aBmin =45 pT. A partir desses dados, inferimos uma concentração mínima detectável de 27 M s1 / 2 (SNR =3). Incorporando todo o tempo morto experimental, a sensibilidade da concentração é ∼45 M s1 / 2. (C) Um espectro de NMR NV de alta resolução da água (parte imaginária da transformada de Fourier) revela uma largura total na metade da largura de linha máxima (FWHM) de 0,65 ± 0,05 Hz. Os dados foram obtidos calculando a média de 60 traços, cada 3 s de duração. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aaw7895
Smits et al. fabricou o chip microfluídico para alojar o sensor de diamante, o dispositivo continha um chip de cobre em uma lâmina de vidro para fornecer as microondas. Os cientistas também incluíram um circuito de excitação de radiofrequência (RF) entre o diamante e a bobina de RMN de feedback, e um canal microfluídico envolvendo o sensor de diamante e o analito de contato. Eles projetaram portas microfluídicas para combinar tubos de analito externos dentro do chip e usaram um feixe de laser de 20 µm de diâmetro para excitar os centros NV através de uma membrana de diamante de 35 µm.
A equipe de pesquisa posteriormente aplicou uma série de sequências de pulsos de microondas XY8-5 ao centro NV para detectar o campo nuclear CA. Eles usaram água deionizada para determinar a sensibilidade e os limites de resolução espectral do aparelho. Para otimizar a resolução espectral, eles ajustaram as bobinas de compensação de gradiente e demonstraram as capacidades do espectrômetro de NMR NV obtendo espectros de NMR de prótons de diversos analitos de fluido.
Por exemplo, os cientistas obtiveram espectros de NMR NV característicos para fosfato de trimetil (TMP) e 1, Compostos de 4-difluorobenzeno (DFB) no estudo. Depois de estabelecer o potencial para detectar espectros de NMR com resolução sub-hertz e altas razões sinal-ruído (SNRs) para os dois compostos, eles usaram a plataforma para realizar espectroscopia 2-D COSY NMR. Por esta, Smits et al. realizaram duas variantes da análise 2-D COSY para sondar as interações nucleares dentro de DFB (1, 4-difluorobenzeno) e executou todas as simulações usando o pacote de software SPINACH para 2-D NMR.
1D NMR. Sinais NV NMR no domínio do tempo (esquerda) e no domínio da frequência (direita) para água (A), (B) fosfato de trimetil (TMP), e (C) 1, 4-difluorobenzeno (DFB). Os sinais foram calculados em média em ± 103 traços para uma aquisição total de ± 1 hora. Um filtro passa-banda de largura de banda de ∼1 kHz é aplicado aos dados no domínio do tempo para melhor visualização. Os espectros no domínio da frequência mostram o componente imaginário da transformada de Fourier. Cada espectro está equipado com funções gaussianas (linhas pretas). Para TMP, restringimos as larguras de ambas as linhas para serem iguais a uma razão de amplitude de 1:1 e encontramos JHP =11,04 ± 0,06 Hz. Para DFB, restringimos as larguras de todas as três linhas para serem iguais a uma razão de amplitude de 1:2:1 e encontramos JHF¯ =6,09 ± 0,05 Hz. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aaw7895.
A resolução sub-hertz demonstrada e as técnicas de NMR multidimensionais podem abrir o caminho para o uso de sensores quânticos de diamante dentro da análise hifenizada em linha, metabolômica de uma única célula e farmacodinâmica de massa limitada. Smits et al. visam a alta resolução espacial resultante e formato de epifluorescência para facilitar a análise química de alto rendimento e imagens de RMN de culturas de células com resolução de célula única. As limitações do presente dispositivo incluem os tempos médios substanciais necessários em concentrações fisiológicas que variam do volume micromolar ao milimolar. Os pesquisadores propõem o uso de campos magnéticos mais elevados com sequências de pulso de microondas XY8-N mais longas e mais sensíveis para melhorar a sensibilidade de NMR e a eficiência de coleta de fótons em contraste com os métodos existentes. A longo prazo, eles esperam que os maiores ganhos de sensibilidade ocorram por meio de métodos de hiperpolarização óptica não invasivos.
2D COSY NMR de DFB. (A) Sequência de pulso COSY homonuclear, (B) espectro simulado, e (C) espectro de NMR de NV experimental de DFB. (D) Uma sequência COSY heteronuclear modificada revela picos fora da diagonal em simulação (E) e experimento (F). As escalas de cores correspondem ao valor absoluto normalizado da transformada de Fourier 2D. Os eixos verticais (f1 - fref) correspondem às frequências da dimensão t1, e os eixos horizontais (f2 - fref) correspondem às frequências da dimensão t2. Em (C), Foram usados 14 valores de t1 em incrementos de 0,021 s até 0,294 s. O tempo total de aquisição foi de 22 horas. Em (F), Foram usados 16 valores de t1 em incrementos de 0,021 s até 0,336 s. O tempo total de aquisição foi de 25 horas. Em ambos os casos, a aquisição t2 variou de 0 a 1,25 s. Todas as simulações foram realizadas usando o pacote SPINACH. Simulação e dados experimentais usam as mesmas funções de janelas. Crédito:Science Advances, doi:10.1126 / sciadv.aaw7895.
O uso de baixa intensidade de campo externo (B 0 ) de 13 mT foi outra limitação do estudo, uma vez que restringiu a capacidade de resolver a divisão espectral devido a mudanças químicas. A equipe tem como objetivo melhorar a resolução do deslocamento químico, aumentando B 0 a ~ 0,25 T, usando o presente esquema de detecção. Além disso, embora o sensor microfluídico NMR tivesse um volume de detecção eficaz de ~ 40 pL, os cientistas precisaram de vários mililitros de analito para preencher o fluxo geral do aparelho. Os chips microfluídicos futuros podem, portanto, miniaturizar ou omitir as etapas de pré-polarização ou usar canais microfluídicos menores para detecção em um sistema fluídico maior.
Desta maneira, Janis Smits e colegas de trabalho demonstraram o uso de sensores quânticos de diamante para aplicações microfluídicas de NMR. Eles mostraram que a separação das etapas de polarização e detecção permitiu uma melhoria de ordem de magnitude na resolução espectral em comparação com os estudos existentes de NMR de diamante. Os cientistas validaram a plataforma realizando RMN 2-D em analitos de fluidos e propuseram suas futuras aplicações em campos de pesquisa multidisciplinares.
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