Uma equipe internacional de cientistas usou pela primeira vez um laser de elétrons livres de raios-X para desvendar a estrutura de uma partícula de vírus intacta no nível atômico. O método usado reduz drasticamente a quantidade de material de vírus necessária, ao mesmo tempo, permite que as investigações sejam realizadas várias vezes mais rápido do que antes. Isso abre oportunidades de pesquisa totalmente novas, como relata a equipe de pesquisa liderada pelo cientista do DESY, Alke Meents, na revista Métodos da Natureza .

No campo conhecido como biologia estrutural, os cientistas examinam a estrutura tridimensional das moléculas biológicas para descobrir como funcionam. Esse conhecimento aumenta nossa compreensão dos processos biológicos fundamentais que ocorrem dentro dos organismos, como a forma como as substâncias são transportadas para dentro e para fora de uma célula, e também pode ser usado para desenvolver novos medicamentos.

"Conhecer a estrutura tridimensional de uma molécula como uma proteína dá uma grande visão de seu comportamento biológico, "explica o co-autor David Stuart, Diretor de Ciências da Vida na instalação de síncrotron Diamond Light Source no Reino Unido e professor da Universidade de Oxford. "Um exemplo é como entender a estrutura de uma proteína que um vírus usa para 'se prender' a uma célula pode significar que somos capazes de projetar uma defesa para a célula para tornar o vírus incapaz de atacá-la."

A cristalografia de raios X é de longe a ferramenta mais prolífica usada por biólogos estruturais e já revelou as estruturas de milhares de moléculas biológicas. Minúsculos cristais da proteína de interesse são cultivados, e, em seguida, iluminada por meio de raios-X de alta energia. Os cristais difratam os raios X de maneiras características, de modo que os padrões de difração resultantes podem ser usados ​​para deduzir a estrutura espacial do cristal - e, portanto, de seus componentes - na escala atômica. Contudo, os cristais de proteína não são nem de longe tão estáveis ​​e resistentes quanto os cristais de sal, por exemplo. Eles são difíceis de crescer, frequentemente permanecendo minúsculo, e são facilmente danificados pelos raios-X.

"Os lasers de raios-X abriram um novo caminho para a cristalografia de proteínas, porque seus pulsos extremamente intensos podem ser usados ​​para analisar até mesmo cristais extremamente minúsculos que não produziriam uma imagem de difração suficientemente brilhante usando outras fontes de raios-X, "acrescenta o co-autor Armin Wagner da Diamond Light Source. No entanto, cada um desses microcristais pode produzir apenas uma única imagem de difração antes de evaporar como resultado do pulso de raios-X. Para realizar a análise estrutural, no entanto, centenas ou mesmo milhares de imagens de difração são necessárias. Em tais experimentos, os cientistas, portanto, injetam um fino jato líquido de cristais de proteína por meio de um laser de raio-X pulsado, que libera uma sequência rápida de rajadas extremamente curtas. Cada vez que um pulso de raios-X atinge um microcristal, uma imagem de difração é produzida e gravada.

Esse método é muito bem-sucedido e já foi usado para determinar a estrutura de mais de 80 biomoléculas. Contudo, a maior parte do material da amostra é desperdiçado. "A taxa de acerto é normalmente inferior a dois por cento dos pulsos, então a maioria dos preciosos microcristais acabam sem uso no recipiente de coleta, "diz Meents, que trabalha no Center for Free-Electron Laser Science (CFEL) em Hamburgo, uma cooperação de DESY, a Universidade de Hamburgo e a Sociedade Alemã Max Planck. O método padrão, portanto, normalmente requer várias horas de feixe e quantidades significativas de material de amostra.

Para usar o tempo de feixe limitado e o precioso material de amostra com mais eficiência, a equipe desenvolveu um novo método. Os cientistas usam um chip micro-padronizado contendo milhares de minúsculos poros para conter os cristais de proteína. O laser de raios-X então examina o chip linha por linha, e, idealmente, isso permite que uma imagem de difração seja gravada para cada pulso do laser.

A equipe de pesquisa testou seu método em duas amostras de vírus diferentes usando o laser de raios-X LCLS no SLAC National Accelerator Laboratory nos EUA, que produz 120 pulsos por segundo. Eles carregaram seu porta-amostras com uma pequena quantidade de microcristais do enterovírus bovino 2 (BEV2), um vírus que pode causar abortos espontâneos, natimortos, e infertilidade em gado, e que é muito difícil de cristalizar.

Neste experimento, os cientistas alcançaram uma taxa de acerto - onde o laser de raios-X atingiu com sucesso o cristal - de até nove por cento. Em apenas 14 minutos, eles coletaram dados suficientes para determinar a estrutura correta do vírus - que já era conhecida por experimentos em outras fontes de luz de raios-X - em uma escala de 0,23 nanômetros (milionésimos de milímetro).

"Para o melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira vez que a estrutura atômica de uma partícula de vírus intacta foi determinada usando um laser de raios-X, "Meents aponta." Enquanto os métodos anteriores em outras fontes de luz de raios-X exigiam cristais com um volume total de 3,5 nanolitros, conseguimos usar cristais que eram mais de dez vezes menores, tendo um volume total de apenas 0,23 nanolitros. "

Esta experiência foi conduzida à temperatura ambiente. Embora o resfriamento dos cristais de proteína os proteja até certo ponto dos danos da radiação, isso geralmente não é viável ao trabalhar com cristais de vírus extremamente sensíveis. Cristais de proteínas de vírus isoladas podem, Contudo, ser congelado, e em um segundo teste, os pesquisadores estudaram a proteína poliedrina viral que constitui um corpo de oclusão viral para até vários milhares de partículas de vírus de certas espécies. As partículas de vírus usam esses recipientes para se proteger contra as influências ambientais e, portanto, são capazes de permanecer intactas por muito mais tempo.

Para o segundo teste, o cientista carregou seu chip com cristais de poliedrina e os examinou usando o laser de raios-X enquanto mantinha o chip em temperaturas abaixo de 180 graus Celsius negativos. Aqui, os cientistas alcançaram uma taxa de acerto de até 90 por cento. Em apenas dez minutos, eles registraram imagens de difração mais do que suficientes para determinar a estrutura da proteína com precisão de 0,24 nanômetros. "Para a estrutura da poliedrina, só tivemos que escanear um único chip carregado com quatro microgramas de cristais de proteína; isto é, ordens de magnitude menor do que a quantidade que normalmente seria necessária, "explica Meents.

"Nossa abordagem não apenas reduz o tempo de coleta de dados e a quantidade de amostra necessária, também abre a oportunidade de analisar vírus inteiros usando lasers de raios-X, "Meents resume. Os cientistas agora querem aumentar a capacidade de seu chip por um fator de dez, a partir de 22, 500 a cerca de 200, 000 microporos, e aumentar ainda mais a velocidade de varredura para até mil amostras por segundo. Isso exploraria melhor o potencial do novo XFEL europeu de laser de elétrons livres de raios-X, que acaba de entrar em operação na região de Hamburgo e terá capacidade para produzir até 27, 000 pulsos por segundo. Além disso, a próxima geração de chips apenas exporá os microporos que estão sendo analisados ​​atualmente, para evitar que os cristais restantes sejam danificados pela radiação espalhada do laser de raios-X.

Pesquisadores da Universidade de Oxford, a Universidade da Finlândia Oriental, o Swiss Paul Scherrer Institute, o Lawrence Berkeley National Laboratory nos EUA e o SLAC também estiveram envolvidos na pesquisa. Cientistas de diamante colaboraram com a equipe do DESY, com grande parte do desenvolvimento e teste do chip micro-padronizado sendo feito nas linhas de luz I02 e I24 da Diamond.