Existem vários métodos para rotular radioativamente o DNA, cada um empregando reações e isótopos diferentes. Aqui estão algumas abordagens comuns:

1. Nick Tradução:

* Reação: Este método usa a enzima DNA polimerase i para substituir os nucleotídeos em uma cadeia de DNA por nucleotídeos marcados. Funciona introduzindo quebras de fita única (Nicks) no DNA usando dNase I . A polimerase então usa o Nick como um primer e incorpora nucleotídeos marcados na lacuna.
* isótopos: Os isótopos comumente usados são ³²pp-dctp ou ³²P-DATP .
* Vantagens: Produz alta atividade específica (densidade do rótulo) e é adequada para o DNA de fita única e dupla.
* Desvantagens: Requer uma enzima específica e pode ser sensível às condições do buffer.

2. Rotulagem aleatória de iniciador:

* Reação: Este método usa iniciadores de oligonucleotídeos aleatórios curtos e polimerase I (Fragmento de Klenow) para sintetizar uma nova fita de DNA complementar à fita de modelo. A polimerase incorpora nucleotídeos marcados durante a síntese.
* isótopos: Os isótopos comumente usados são ³²pp-dctp ou ³²P-DATP .
* Vantagens: Eficiente e pode ser usado para rotular o DNA de fita única e dupla.
* Desvantagens: Pode introduzir alguma rotulagem de fundo devido à ligação aleatória do iniciador.

3. Rotulação final com cinases:

* Reação: Este método usa polynucleotídeo quinase Para adicionar um grupo fosfato na extremidade 5 'de um fragmento de DNA. O grupo fosfato é rotulado com um isótopo radioativo.
* isótopos: Normalmente ³²P-ATP ou ³P-ATP são usados.
* Vantagens: Simples e direto, especialmente útil para rotular fragmentos de DNA curto.
* Desvantagens: Apenas rotula o final do DNA de 5 '.

4. Rotulagem de PCR:

* Reação: Este método envolve o uso de DNTPs radioativos (como ³²p-dctp ) durante a reação de PCR. Isso incorpora o rótulo nos fios de DNA recém -sintetizados.
* isótopos: Os isótopos comumente usados são ³²pp-dctp ou ³²P-DATP .
* Vantagens: Eficiente e pode ser usado para rotular sequências específicas de DNA.
* Desvantagens: Pode ser menos eficiente que outros métodos e pode ser difícil obter alta atividade específica.

5. Transcrição in vitro:

* Reação: Usa RNA polimerase Para transcrever um modelo de DNA para o RNA. O RNA é rotulado com nucleotídeos radioativos durante a síntese.
* isótopos: Normalmente ³²P-UTP ou ³⁵s-utp .
* Vantagens: Pode produzir sondas de RNA altamente rotuladas para estudos de hibridação.
* Desvantagens: Requer reagentes e condições especializados para a transcrição in vitro.

A escolha do método de rotulagem depende da aplicação específica e das propriedades desejadas do DNA rotulado.

Nota: O uso de isótopos radioativos tem diminuído nos últimos anos devido a preocupações de segurança e à disponibilidade de métodos de rotulagem não radioativos. No entanto, a rotulagem radioativa ainda tem algumas vantagens em determinadas aplicações, principalmente para sensibilidade e capacidade de detectar alvos de baixa abundância.