O hidróxido de sódio (NaOH) desempenha um papel crucial no procedimento de lise usado para obter moléculas de plasmídeo covalentemente fechadas. Este procedimento visa lisar células bacterianas e liberar seu conteúdo celular, incluindo DNA plasmidial. O NaOH facilita especificamente a desnaturação do DNA cromossômico, preservando a integridade do DNA plasmidial. Aqui está uma explicação detalhada do papel do NaOH no procedimento de lise:

Lise celular:
- O procedimento de lise normalmente começa com a ressuspensão das células bacterianas num tampão contendo NaOH. Este tampão cria um ambiente alcalino com pH alto, geralmente em torno de pH 12-12,8.
- Neste pH elevado, as membranas celulares e as paredes celulares das bactérias são rompidas, levando à lise celular. Os componentes celulares, incluindo DNA plasmídico, são liberados no lisado.

Desnaturação do DNA cromossômico:
- O ambiente de alto pH criado pelo NaOH visa e desnatura especificamente o DNA cromossômico das bactérias. O DNA cromossômico é tipicamente grande e complexo, consistindo em uma única molécula circular.
- As fortes condições alcalinas provocam a quebra das ligações de hidrogénio entre as cadeias complementares de ADN, resultando na desnaturação e fragmentação do ADN cromossómico. Esta desnaturação perturba efectivamente a integridade estrutural do ADN cromossómico, tornando-o não funcional.

Preservação do DNA plasmidial:
- Ao contrário do DNA cromossômico, o DNA plasmidial é mais resistente à desnaturação pelo NaOH. As moléculas de plasmídeo são tipicamente pequenas, circulares e de fita dupla, com uma estrutura superenrolada que aumenta sua estabilidade.
- A conformação superenrolada do DNA plasmídico permite que ele resista melhor às condições alcalinas do que o DNA cromossômico. Portanto, enquanto o DNA cromossômico é desnaturado, o DNA plasmídico permanece intacto e mantém sua estrutura circular covalentemente fechada.

Neutralização:
- Após a etapa de lise, o lisado contendo o DNA cromossômico desnaturado e o DNA plasmídico intacto é neutralizado usando um tampão contendo um agente neutralizante, como Tris-HCl ou tampão acetato.
- A neutralização traz o pH do lisado de volta a uma faixa fisiológica, normalmente em torno de pH 7-8. Esta etapa é essencial para interromper o processo de desnaturação e garantir a estabilidade do DNA plasmídico.

Isolamento de DNA plasmídico:
- Após a neutralização, o lisado pode ser processado posteriormente para isolar o ADN plasmídico. Isto pode envolver etapas adicionais, tais como centrifugação, purificação e técnicas de separação baseadas no tamanho para separar o DNA plasmídico de outros componentes celulares.

Ao desnaturar seletivamente o DNA cromossômico e ao mesmo tempo preservar a integridade do DNA plasmidial, o NaOH desempenha um papel crítico no procedimento de lise, permitindo o isolamento eficiente de moléculas plasmídicas covalentemente fechadas para várias aplicações downstream, incluindo sequenciamento de DNA, clonagem e experimentos de engenharia genética.