O método rápido ajuda a detectar a atividade do fator de troca de nucleotídeos guanina Arf6
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Método baseado em F NMR para detecção de atividade de Arf6 GEF. Crédito:Wu Bo
Uma equipe de pesquisa liderada pelo Prof. Wang Junfeng do Hefei Institutes of Physical Science (HFIPS) da Academia Chinesa de Ciências (CAS) desenvolveu um novo flúor-19 unidimensional (1D) (
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F) método baseado em ressonância magnética nuclear (RMN) para detecção rápida da atividade do fator de troca de nucleotídeo guanina Arf6 (GEF).
Seus resultados foram publicados em
Analytical Chemistry em 6 de junho.
Pequenas GTPases (sGTPase) estão envolvidas em cascatas de sinais que controlam uma ampla gama de respostas celulares. Todas as sGTPases podem ser encontradas em dois estados:um estado inativo no qual a pequena GTPase está ligada ao difosfato de guanosina (GDP) e um estado ativo no qual está ligada ao trifosfato de guanosina (GTP). O ciclo GTPase formado pela interconversão entre os dois estados é estritamente regulado por fatores de troca de nucleotídeos guanina (GEFs) e proteínas ativadoras de GTPase (GAPs).
Mutação ou regulação anormal de proteínas sGTPase ou seus respectivos GEFs/GAPs estão intimamente relacionados a muitas doenças, incluindo câncer. Portanto, é importante detectar a atividade dessas proteínas GEF/GAP tanto in vitro quanto in vivo.
Neste estudo, os pesquisadores incorporaram o local de aminoácido não natural tfmF especificamente em Phe47 de sGTPase Arf6, uma posição localizada no domínio de comutação ARF6 cuja conformação muda mais durante o ciclo GTPase. E eles desenvolveram o 1D
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Método baseado em F NMR para detectar a atividade de GEF no sistema de proteína purificada ou na presença dos lisados celulares.
Para um ensaio de atividade GEF, a amostra de Arf6-F47 tfmF carregado com GDP foi colocada no espectrômetro o mais rápido possível após a adição de um GEF e GTP. Uma série sequencial de 1D
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Os espectros de F NMR foram coletados. O sinal de Arf6-F47 tfmF no estado ligado a GTP foi processado e integrado. As curvas cinéticas de troca foram então plotadas e ajustadas a uma curva de crescimento exponencial monofásica para extrair a taxa.
"Esta estratégia pode potencialmente ser usada para monitorar a mudança conformacional de Arf6 ou outra sGTPase", disse Wu Bo, primeiro autor do estudo, "ela pode detectar as atividades de proteínas reguladoras de sGTPases em ambientes de fisiologia e patologia".
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