Para entender como as moléculas individuais desempenham seus papéis nos processos biológicos dentro das células nas quais são sintetizadas, pesquisadores desenvolveram métodos de microscopia de super-resolução para visualizá-los no nível de uma única molécula. Contudo, para investigar suas funções, em última análise, eles também gostariam de poder modificá-los individualmente nesta alta resolução. Embora a visualização de moléculas individuais tenha feito grandes avanços nos últimos anos, até agora, continua sendo um desafio modificá-los diretamente de forma controlada, moda molécula a molécula.

Agora, relatado em Química da Natureza , pesquisadores do Instituto Wyss de Engenharia Inspirada na Biologia de Harvard e da Harvard Medical School (HMS), desenvolveram "Action-PAINT, "um método que combina a abordagem de microscopia de super-resolução DNA-PAINT em tempo real da equipe com uma estratégia de marcação de molécula única em um local desejado dentro de nanoestruturas sintéticas ou células intactas. Esta abordagem poderia ser desenvolvida para permitir que os pesquisadores estimulem ou inibam o funções de moléculas individuais e estudar as consequências para processos biológicos normais e relacionados com doenças em tempo real e super-resolução.

"Os métodos de imagem de super-resolução nos permitiram 'ver o que antes era invisível." Ao acoplar nosso método de microscopia de super-resolução DNA-PAINT com uma abordagem de reticulação, agora também podemos 'tocar o que antes era inacessível', anexando uma alça física a moléculas individualmente observáveis ​​no momento da visualização, "disse Peng Yin, membro do corpo docente do Wyss Institute, Ph.D., quem conduziu o estudo. Yin também é co-líder da Iniciativa de Robótica Molecular do Instituto, e Professor de Biologia de Sistemas no HMS.

A equipe de Yin desenvolveu uma abordagem em duas etapas que primeiro visualiza proteínas únicas ou outras moléculas em super-resolução, e então transfere um rótulo molecular para o local de destino desejado. Opcionalmente, os pesquisadores podem confirmar transferências bem-sucedidas com uma rodada adicional de imagens de super-resolução.

A primeira etapa da imagem de molécula única depende do método DNA-PAINT que permitiu à equipe determinar primeiro a localização precisa de moléculas ou características moleculares que são separadas espacialmente por distâncias bem abaixo do limite de difração da luz, e, portanto, invisível para a maioria dos microscópios. Os pesquisadores primeiro anexaram uma curta "fita de acoplamento" de DNA ao alvo que serve como um local de ligação para uma "fita de imagem" complementar carregando um corante fluorescente. Como o filamento do imager se liga a uma taxa de ativação / desativação programável, produz eventos de "piscar" definidos que podem ser observados usando microscópios padrão. Para anexar uma etiqueta física ao alvo, os pesquisadores realizaram sua primeira etapa de imagem de super-resolução com um filamento de imagem um pouco mais complexo que também incluiu um reticulador fotoindutível, que é capaz de ligar quimicamente o encaixe e o filamento do gerador de imagens um ao outro quando exposto à radiação UV, e uma sequência repórter adicional.

"Um componente crítico de nosso novo método é o controle preciso do laser de reticulação, que funciona em sincronia com a seqüência piscante de super-resolução. Isso realmente converte nossa microscopia de super-resolução DNA-PAINT de um método de imagem passivo para um ativo, permitindo a interação em tempo real entre o pesquisador e os alvos moleculares individuais, "disse o co-primeiro e co-autor Mingjie Dai.

Para habilitar esse novo recurso, a equipe desenvolveu um pacote de software que lhes permitiu primeiro mapear as localizações precisas de todos os alvos moleculares em uma área de interesse usando o método DNA-PAINT, e, em seguida, sincronize fortemente o piscar de um UV com os eventos de piscar subsequentes. "Desta forma, poderíamos ligar quimicamente a fita do imager a alvos moleculares personalizados, um por um, com resolução molecular - como um pintor estabelece sua cor, remendo por remendo no estilo do pontilhismo, "disse Dai, Ph.D., um ex-pós-doutorado da equipe de Yin, atualmente é membro do Departamento de Biologia de Sistemas e Desenvolvimento de Tecnologia da HMS no Instituto Wyss.

Para demonstrar a eficácia e seletividade de sua abordagem, a equipe usou primeiro nanoestruturas de DNA sintético que expuseram locais de encaixe para filamentos de imagens em padrões definidos. "Colocando Action-PAINT para funcionar, começamos demonstrando sua eficácia rotulando alvos de molécula única distantes apenas 30 a 70 nm de seus vizinhos idênticos com alta eficiência no alvo, "disse o co-primeiro autor Ninning Liu, Ph.D., "e depois validou nosso método em células fixas, onde selecionamos e marcamos proteínas de microtúbulos ao longo dos filamentos do citoesqueleto, com diferentes padrões personalizados. "Liu é um pós-doutorado da equipe de Yin.

Os autores imaginam que o Action-PAINT poderia ser desenvolvido em uma ferramenta amplamente aplicável que, por exemplo, poderia ajudar a modificar diretamente as atividades de receptores de membrana única na superfície das células, de onde eles direcionam o comportamento celular, ou de canais iônicos que controlam a função das células neuronais. Além disso, os métodos podem permitir a transferência de alças moleculares para proteínas individuais que podem permitir sua extração e purificação junto com outras proteínas às quais se ligam naturalmente.

"Action-PAINT adiciona outro nível de funcionalidade aos recursos desenvolvidos pela equipe de Peng Yin que podem permitir o mapeamento de interação de proteína funcional com base na posição molecular dentro de células individuais, e a análise bioquímica dessas interações, uma vez que essas moléculas são isoladas, que no futuro pode ajudar a identificar e / ou validar novos alvos de drogas, "disse o Diretor Fundador do Wyss Institute, Donald Ingber, M.D., Ph.D.