Pesquisadores do Instituto de Físico-Química da Academia Polonesa de Ciências demonstraram, usando uma técnica microscópica de super-resolução, como acompanhar as reações químicas que ocorrem em volumes muito pequenos. O método foi desenvolvido em colaboração com PicoQuant GmbH, e torna possível observar reações dentro de organelas celulares individuais, como núcleos celulares.

Os mecanismos químicos responsáveis ​​pelas funções vitais das células ainda escondem muitos segredos - só recentemente os pesquisadores tiveram as ferramentas para examinar diretamente os fenômenos químicos que ocorrem nas células vivas. Contudo, devido a limitações técnicas contínuas, a ciência carece de conhecimento básico sobre os valores constantes de equilíbrio das reações químicas nas células. Em outras palavras, os pesquisadores ainda não sabem quanto de uma substância química envolvida em uma determinada reação celular está em uma forma já reagida e quanto está na forma não reagida. Esses desafios foram superados no presente estudo. A pesquisa colaborativa desenvolveu e demonstrou uma modificação da espectroscopia de correlação de fluorescência de super-resolução.

“Há muito tempo lidamos com reações químicas em células. Por exemplo, em 2013, determinamos os coeficientes de difusão de todas as proteínas da bactéria Escherichia coli, graças ao qual foi possível determinar a taxa de reações que ocorrem com sua participação. Aqui, estávamos interessados ​​em uma questão semelhante em situações que envolvem baixas concentrações de reagentes, "diz o Prof. Robert Holyst (IPC PAS)." As reações biológicas são geralmente reversíveis e, onde eles ocorrem, um certo equilíbrio dinâmico é geralmente criado entre a quantidade de substâncias reagidas e não reagidas. Em nossas tentativas de determinar as constantes de equilíbrio para várias reações nas células, olhamos para espectroscopia de correlação de fluorescência de super-resolução. E aqui, nos deparamos com um problema técnico interessante, cuja solução nos abriu novas possibilidades no estudo da química da vida. "

Existem muitas variedades de microscopia, incluindo aqueles que visualizam átomos individuais. Contudo, ao observar células, A microscopia óptica permanece imbatível devido à sua baixa invasividade e a capacidade de visualizar a estrutura espacial dos organismos vivos. Por muito tempo, sua desvantagem básica era sua resolução relativamente pobre - restrições físicas fundamentais (difração) tornam impossível distinguir detalhes menores do que cerca de 200 nanômetros por técnicas ópticas padrão.

Um tipo de microscopia óptica é a microscopia de fluorescência. Envolve a introdução de um corante fluorescente nos locais da amostra biológica em estudo, e, em seguida, digitalizar a amostra com um feixe de laser focado, que estimula as moléculas de corante a brilhar. Em 1994, Stefan W. Hell apresentou um método para ultrapassar o limite de difração em microscopia de fluorescência por meio da depleção de emissão estimulada (STED). STED requer um feixe de laser adicional semelhante a um donut em seção transversal. Este feixe extingue as áreas externas do foco principal do feixe de laser e consequentemente reduz seu tamanho para valores abaixo do limite de difração. Com métodos de super resolução, agora é possível ver detalhes espaciais de apenas 10 nm com uma resolução de tempo de até microssegundos.

A espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS) é um novo ramo da microscopia óptica para estudar o movimento das moléculas. Em variedades de super-resolução, o foco do laser tem um volume medido em dezenas de atolitros (um atolitro é um bilionésimo de um bilionésimo de um litro). A medição envolve medir a luz emitida por um corante fluorescente ligado à molécula testada excitada por um feixe de laser. Sabendo o tamanho do foco e a duração da fluorescência, e com a ajuda de modelos teóricos apropriados, é possível determinar a velocidade até de moléculas individuais.

"Por algum tempo, sabe-se que, embora a microscopia FCS de super-resolução funcione bem ao observar moléculas se movendo em duas dimensões, por exemplo. nas membranas lipídicas, falha em observações em volumes. Tempos de difusão, determinado com base em medições em 3-D, podem diferir das previsões das medições em 2-D em uma ordem de magnitude ou até mais. Depois de alguns meses de pesquisa, ficou claro para nós que essas discrepâncias se deviam à maneira excessivamente simplificada de determinar o tamanho espacial do foco, "diz o Dr. Krzysztof Sozanski (IPC PAS).

Com base em suas próprias análises teóricas e experiências, os pesquisadores de Varsóvia construíram um novo, modelo teórico universal que introduz uma correção da forma espacial do foco e leva em consideração seu impacto na relação sinal-ruído medida. A exatidão do modelo foi inicialmente verificada em medições da taxa de difusão de várias sondas fluorescentes em soluções.

“Também fizemos experimentos mais avançados. Por exemplo, estudamos uma reação reversível na qual as moléculas do corante se ligam às micelas e se separam depois de algum tempo. O sistema, composto de bolas relativamente grandes de moléculas de surfactante reagindo com as moléculas de corante, condições refletidas características de estruturas biológicas, "diz o estudante de doutorado Xuzhu Zhang (IPC PAS). As medições não eram simples. Se as moléculas de ambos os reagentes estivessem se movendo lentamente, ao passar pelo foco, o corante poderia se fundir / desconectar repetidamente com / das micelas e a luz emitida seria calculada.

Mas também poderia haver uma variante do outro extremo:as reações de conexão e desconexão poderiam ocorrer tão lentamente que durante a transição pelo foco não haveria mudança na relação entre os reagentes - então não haveria média. "Nosso modelo leva em consideração não apenas os casos extremos, mas também todos os intermediários. E com o conhecimento à nossa disposição sobre o tamanho real do foco, somos capazes de alterar seu tamanho e examinar experimentalmente todos os casos exigidos pelo modelo no mesmo sistema químico e no mesmo equipamento, "enfatiza Zhang.

Uma característica importante do método analítico desenvolvido no IPC PAS é o fato de não serem necessárias modificações no aparelho para sua aplicação. Após a adaptação adequada, o método pode ser usado para interpretar com mais precisão os dados registrados por microscópios STED prontos para FCS já em produção.