Um esquema de desenvolvimento de Gamillus. O gene da proteína fluorescente foi clonado a partir de tentáculos de água-viva de chapéu de flores, e foi projetado para melhorar a propriedade monomérica e o brilho. (O chapéu de flor água-viva foi fornecido pelo Sr. Kamoizumi no Aquário de Kamo, Yamagata, Japão.) Crédito:Aquarium and Osaka University
Pesquisadores da Universidade de Osaka desenvolvem uma nova proteína fluorescente verde que pode suportar ambiente de baixo pH para imagens de organelas ácidas
A visualização de componentes e processos celulares em nível molecular é importante para compreender a base de qualquer atividade biológica. Proteínas fluorescentes (FPs) são uma das ferramentas mais úteis para investigar a dinâmica molecular intracelular.
Contudo, FPs têm limitações de uso para imagens em ambientes de baixo pH, como em organelas ácidas, incluindo endossomos, lisossomos, e vacúolos vegetais. Em ambientes de pH inferior a 6, a maioria dos FPs perde seu brilho e estabilidade devido ao seu pKa neutro. pKa é a medida da força do ácido; quanto menor for o pKa, mais ácida é a substância.
"Embora haja relatos de vários FPs verdes tolerantes a ácido (GFPs), a maioria tem sérias desvantagens. Além disso, há uma falta de GFPs tolerantes a ácido que são praticamente aplicáveis à bioimagem, "diz Hajime Shinoda, autor principal de um estudo da Universidade de Osaka que teve como objetivo projetar GFP monomérico tolerante a ácido que é praticamente aplicável à imagem de células vivas em organelas ácidas. "No estudo atual, desenvolvemos um GFP tolerante a ácido. Nós o chamamos de Gamillus. "
Figura 2. (Esquerda) propriedade de fluorescência dependente do pH de Gamillus e EGFP. (À direita) Imagens de fluorescência de células HeLa expressando Gamillus ou EGFP. Gamillus permite a observação por fluorescência da migração de proteínas para os lisossomas causada pela macroautofagia. Barra de escala, 10 μm. Crédito:Universidade de Osaka
Gamillus é um GFP clonado de Olindias formosa (água-viva de chapéu de flor) e exibe tolerância ao ácido superior (pKa =3,4) e quase o dobro do brilho em comparação com os GFPs relatados. O espectro de fluorescência é constante entre pH 4,5 e 9,0, que fica entre a faixa intracelular na maioria dos tipos de células. Cristalografia de raios-X (uma técnica usada para determinar a estrutura atômica e molecular de um cristal, nesse caso, um cristal de Gamillus) e a mutagênese pontual sugerem que a tolerância ao ácido de Gamillus é atribuída à estabilização da desprotonação em sua estrutura química. Os resultados foram publicados em Biologia Química Celular .
"A aplicabilidade do Gamillus como uma etiqueta molecular foi mostrada pelo padrão de localização correto das fusões Gamillus em uma variedade de estruturas celulares, incluindo aqueles que são difíceis de direcionar, "diz o autor correspondente, Takeharu Nagai." Acreditamos que Gamillus pode ser uma ferramenta molecular poderosa para investigar fenômenos biológicos desconhecidos envolvendo organelas ácidas, como autofagia. "
