Um tipo modificado da proteína Eos pode tornar-se fluorescente quando iluminado com luz laser azul e vermelha. Antecedentes:duas proteínas do citoesqueleto em azul e vermelho. A proteína visível em vermelho foi marcada com o novo tipo Eos modificado. (Montagem:Mohr MA et al. Angewandte Chemie 2017. Copyright Wiley-VCH. Reproduzido com permissão)
Os cientistas identificaram o mecanismo que permite que as proteínas fluorescentes mudem de cor em duas fases. Eles estão, portanto, preparando as bases para novas aplicações em microscopia e análises funcionais em pesquisa biológica.
Tudo começou com uma observação que os cientistas da ETH fizeram cerca de dois anos atrás com uma proteína fluorescente especial isolada de corais, Dendra 2, que fica com uma fluorescência verde. A luz pode ser usada para mudar sua estrutura molecular de modo que mude sua cor para vermelho. Os pesquisadores descobriram uma nova maneira de induzir essa mudança de cor:primeiro, ele é brevemente excitado com um pulso de luz laser azul e então iluminado imediatamente com luz infravermelha próxima. As aplicações para esta mudança de cor de duas fases incluem microscopia de fluorescência.
Uma equipe internacional de pesquisadores liderada por Periklis Pantazis, do Departamento de Ciência e Engenharia de Biossistemas (D-BSSE) da ETH Zurich em Basel, já explicou este mecanismo de mudança de cor de duas fases. Os cientistas se referem a isso como "conversão preparada". O novo conhecimento permite que os pesquisadores modifiquem outras proteínas sensíveis à luz para que também possam ser excitadas em duas fases.
Os pesquisadores da ETH Zurique, o Instituto de Tecnologia de Karlsruhe, e o Campus de Pesquisa Janelia em Ashburn, Virgínia, examinou de perto as proteínas ativadas com luz azul e conseguiu mostrar que essas proteínas entram em um estado de excitação que dura vários milissegundos. "É relativamente longo, "explica Pantazis." Outros fenômenos de fluorescência são muito mais curtos. "
Os cientistas também demonstraram que esse estado é o caso de um fenômeno conhecido da química quântica - um "estado tripleto". Após cerca de cinco milissegundos, a proteína fluorescente Dendra 2 retorna ao seu estado fundamental. A conversão preparada ocorre apenas se a segunda fase - iluminação com luz infravermelha próxima - ocorrer dentro da janela de tempo do trio.
Sequências de aminoácidos modificadas
A duração do estado tripleto depende muito da estabilidade da proteína fluorescente. Esse, por sua vez, depende da sequência exata de blocos de construção de proteínas (aminoácidos), é por isso que os cientistas modificaram a sequência de aminoácidos Dendra 2 em vários pontos. Então, eles fizeram o mesmo com outra proteína fluorescente, Eos. Até agora, esta proteína não pode ser excitada em duas fases. Está documentado na literatura científica que esses locais são essenciais para o estado de trigêmeos.
Quando o Dendra 2 (à direita com seu composto químico fluorescente) é iluminado com luz laser azul, fica verde fluorescente. Com luz violeta, ele muda sua estrutura química de modo que só pode ficar vermelho fluorescente. Esta mudança de estrutura química também ocorre quando iluminada brevemente com luz azul e imediatamente depois com luz vermelha (ou com luz laser azul e vermelha simultaneamente). Crédito:ETH Zurique
Os cientistas mediram a duração do estado tripleto com todas as novas proteínas. Este estado foi estendido significativamente em várias das proteínas testadas. Os cientistas também foram capazes de modificar a proteína Eos para que ela também pudesse ser ativada em duas fases. Eles conseguiram fazer isso com outras seis proteínas que nunca haviam sido ativadas em duas fases antes. "As proteínas modificadas não foram apenas alternadas em duas fases pela primeira vez; elas também são mais estáveis e, portanto, apresentam fluorescência mais intensa, "diz Manuel Mohr, estudante de doutorado no grupo de Pantazis e principal autor do estudo.
Os cientistas fizeram a descoberta original com um laser que não está disponível convencionalmente, que usa luz na faixa do infravermelho próximo. Hoje, Contudo, os cientistas demonstraram que o efeito também pode ser alcançado usando os mesmos lasers vermelhos convencionais encontrados em todos os microscópios de fluorescência. Em outras palavras, a conversão inicial é possível com qualquer microscópio de fluorescência.
A conversão preparada pode ser usada em microscopia para marcar um ponto estreitamente definido em uma amostra de tecido. Os cientistas fazem isso apontando um feixe de laser azul e vermelho para o tecido, de modo que os feixes se cruzem em um único ponto. A conversão preparada ocorre apenas nesta interseção. "Because neither blue nor red laser light have a toxic effect, the method is ideal for living organisms, " says Pantazis. Applications with other microscopy techniques may also be possible, including super-resolution microscopy, which has been around for several years now.
Brain mapping and gene sequencing
"We now know how to modify photoconvertible proteins to make them switch in two phases, " says Pantazis. The ETH scientists are working together with protein experts to modify other fluorescent proteins used in microscopy in the same way.
The researchers recently modified proteins so that they can be split off from a gene-activating messenger in a way that allows them to be light-activated with two colours. Por exemplo, they could illuminate tissue with a blue and red beam intersecting at a single point, making it possible to activate specific genes in a single cell of the tissue. Proteins that detect calcium can be modified in this way, as well, and could potentially be used for 3-D brain mapping.
Biologists can ultimately use the new technique for other functional analyses in 3-D. ETH Zurich has already issued several licences for the patent, including to a start-up that plans to develop a DNA sequencing technique using a 3-D matrix.
