Um novo método para melhorar o alto rendimento, alta pureza, a purificação de alta atividade de proteínas complexas em 10 a 500 vezes foi desenvolvida na University of Alabama em Birmingham.

"Este novo método oferece uma série de vantagens cruciais para os pesquisadores e para a indústria farmacêutica, "disse Dmitry Vassylyev, professor de bioquímica e genética molecular da UAB. "É potencialmente a ferramenta mais eficiente e universal para estudos de alto rendimento de muitos sistemas biológicos importantes e pode auxiliar na produção em grande escala de proteínas terapêuticas."

Alto rendimento, alta pureza, purificação de alta atividade, ou HHH, é o Santo Graal para aplicações estruturais e industriais. O esquema de purificação de etapa única UAB supera fraquezas significativas dos atuais sistemas de purificação disponíveis comercialmente, Vassylyev diz.

Em um artigo publicado em Proceedings of the National Academy of Sciences , Vassylyev e colegas da UAB testaram seu método de purificação por cromatografia de afinidade CL7 / Im7 em cinco moléculas biológicas tradicionalmente desafiadoras, incluindo proteínas de membrana procarióticas e eucarióticas e proteínas de ligação a DNA / RNA de várias subunidades.

"Uma ilustração notável do desempenho superior da abordagem CL7 / Im7, "eles escreveram no relatório PNAS, "é que a amostra de proteína CNX, que purificamos em poucas horas e a partir de apenas alguns gramas de células de E. coli, teria um valor de mercado de cerca de US $ 400, 000, de acordo com os preços comerciais atuais. "

O sistema é simples e reutilizável - os pesquisadores da UAB restauraram e reutilizaram sua coluna de cromatografia de afinidade mais de 100 vezes, mantendo quase 100 por cento da capacidade de ligação.

O método é baseado na afinidade de ligação notavelmente forte entre as toxinas bacterianas chamadas colicinas e suas proteínas de imunidade específicas. Uma bactéria hospedeira pode liberar uma toxina colicina - como a Colicina E7 DNAse - que é capaz de matar outras bactérias. Dentro da bactéria hospedeira, o CE7 está ligado à Proteína de Imunidade 7, ou Im7; essa amarração evita a destruição autoinfligida.

A afinidade de ligação de CE7 / Im7 é quase tão forte quanto uma ligação covalente, e é quatro a sete ordens de magnitude maior do que outros análogos da cromatografia de afinidade. Vassylyev e colegas criaram uma variante inativa do CE7, chamado CL7, que não tem atividade DNase, mas retém afinidade de ligação total para Im7. Eles também fizeram uma variante do Im7 que permite o acoplamento eficiente a grânulos de agarose.

Usando técnicas genéticas, a tag CL7 é facilmente inserida em genes de proteínas-alvo, em ambos os eucariontes e procariontes. Esses genes podem ser movidos para um vetor de expressão, ou a proteína alvo marcada pode ser expressa a partir de células nativas sem amplificação.

Quando um lisado de proteína bruta é derramado através de uma coluna preenchida com os grânulos de agarose Im7, as marcas CL7 na proteína alvo ligam-se ao Im7. Um local de protease projetado é usado para liberar a proteína alvo da tag CL7 ligada. Isso permite a purificação de HHH em uma etapa, com pureza de 97 a 100 por cento, para as proteínas-alvo testadas pelos pesquisadores da UAB.

Em contraste, a maioria dos esquemas de purificação publicados para essas proteínas desafiadoras são de várias etapas, protocolos de vários dias, com rendimentos mais baixos. Vassylyev, um cristalógrafo de proteínas, diz que obter grandes quantidades de proteína pura é a etapa limitante da taxa na cristalografia, levando-o a iniciar uma busca por um método melhor há quatro anos.

As proteínas desafiadoras purificadas no relatório PNAS foram bacteriana Thermus thermophilus RNA polimerase e Mycobacteria tuberculosis RNA polimerase, que são proteínas com várias subunidades; YidC membrana integrase, uma proteína de membrana Bacillus halodurans; calnexina, ou CNX, uma proteína chaperona transmembrana humana; e duas proteínas de ligação de ácido nucleico, o complexo de proteína condensina multissubunidade de Salmonella typhimurium que dobra e compacta o DNA celular, e o remodelamento humano e complexo de fator de espaçamento, RSF, que está implicado na mediação da montagem do nucleossomo.

O sistema de purificação simples também é aplicável a experimentos suspensos e atividade cinética ou ensaios de ligação, como ressonância de plasmon de superfície. Também pode auxiliar a microscopia crioeletrônica.