Ao trabalhar com cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), é essencial uma boa calibração para garantir resultados confiáveis e de qualidade. A calibração adequada de um instrumento de HPLC começa com a elaboração de um padrão de calibração adequado. Na maioria dos casos, a calibração exige uma série de padrões de concentração crescente para produzir o que é conhecido como curva de calibração. Esta é uma linha traçada e uma equação associada que descreve a relação entre a concentração da substância a ser testada e a resposta do detector de HPLC.
Determine a substância química que você deseja testar usando a HPLC (a " analito"). Por exemplo, você pode querer testar uma série de refrigerantes para obter o teor de frutose, em cujo caso a frutose seria o analito.
Obtenha uma quantidade do analito químico de pureza adequada. Normalmente, a pureza deve estar acima de 99% e o analito deve ser comprado de uma empresa de fornecimento de produtos químicos de boa reputação. No caso da frutose, por exemplo, você compraria frutose pura de um vendedor de produtos químicos e não de uma mercearia.
Determine as concentrações máximas e mínimas previstas do analito nas amostras que você pretende testar na HPLC. No caso dos refrigerantes, você examinaria os rótulos das bebidas e determinaria o menor e mais alto teor de frutose dentre as bebidas que testaria. Tenha em mente que a amostra inicial (o refrigerante) pode ser diluída ou manipulada durante a preparação para análise (dependendo do método de HPLC em uso) e assim a concentração do analito nas amostras realmente injetadas na HPLC pode ser modificada. É a concentração do analito nas amostras, conforme executado na HPLC, que deve ser considerada.
Determine o solvente no qual você dissolverá seu analito para compensar os padrões de calibração. Este solvente deve ser capaz de dissolver adequadamente o analito em uma faixa de concentração relativamente ampla (pelo menos tão alta quanto nas amostras que você pretende testar). Além disso, esse solvente deve idealmente ser bastante semelhante à "fase móvel": o solvente usado para transportar amostras através do instrumento de HPLC.
Calcule a quantidade de analito necessária para fazer uma solução "padrão de estoque" da amostra. analito. Isto é encontrado multiplicando a concentração necessária do padrão de estoque pelo volume desejado. A concentração do analito nesta solução deve ser pelo menos 10% maior do que a maior concentração de amostra prevista. Se a concentração de frutose mais alta esperada em uma amostra de refrigerante for 8 gramas /100 mililitros, então o padrão de estoque pode ser feito para uma concentração de 10 gramas de frutose /100 mililitros. Um volume razoável é de 500 mililitros, portanto, 8/100 mL x 500 mL = 40 gramas de frutose seria necessário.
Pesar a quantidade necessária de analito para um nível adequado de precisão. Muitas vezes, um valor de peso em gramas precisos para uma ou duas casas decimais é adequado, mas pode ser necessária mais precisão para alguns métodos.
Transfira o analito pesado para um balão volumétrico do volume necessário e adicione o solvente desejado para a marca de preenchimento no frasco. O uso de um balão volumétrico (em vez de um béquer graduado, por exemplo) aumenta a precisão do valor de concentração padrão em estoque. Assegure-se de que todo o analito seja transferido para o frasco; use um pouco do solvente para lavá-lo, se necessário.
Feche o frasco volumétrico e agite ou inverta suavemente até que o analito esteja completamente dissolvido.
Faça uma série de diluições variadas do estoque padrão, transferindo volumes conhecidos do padrão de estoque para frascos volumétricos, usando pipetas para uma transferência precisa e depois adicionando solvente. A menor concentração padrão deve estar abaixo da menor amostra antecipada a ser analisada. No exemplo dos refrigerantes, se a menor concentração esperada de frutose em uma amostra for 2 gramas /100 mL, então um padrão de 1 grama /100 mL pode ser feito. Isso seria feito por uma diluição dez vezes maior do padrão de estoque. A série padrão deve incluir um total de 5 ou 6 concentrações, portanto seriam necessárias diluições adicionais para produzir padrões de talvez 3, 5 e 8 gramas de frutose /mL. Agora você tem uma série de soluções padrão para calibrar a HPLC.
Dica
É possível fazer padrões de calibração contendo mais de um analito, se necessário. Geralmente é uma boa prática filtrar amostras de calibração (e padrões) antes de injetá-las na HPLC para remover quaisquer partículas finas que possam ligar o instrumento.
Aviso
Alguns padrões se degradam rapidamente após serem feito. Assegure-se de que seus padrões sejam substituídos freqüentemente se este for o caso. Como com todos os procedimentos químicos, observe as precauções adequadas ao trabalhar com analitos ou solventes potencialmente prejudiciais, como aqueles que são tóxicos ou inflamáveis.
