Aqui está um colapso das etapas que um cientista adotaria para encontrar o gene responsável por uma proteína produzida pelo fígado, usando mRNA e cDNA, e depois produzi -lo em células de sapo:

1. Isolando o mRNA do fígado

* Coleção de tecidos: O cientista obteria tecido hepático de um animal (idealmente uma espécie semelhante ao sapo, mas pode ser uma espécie diferente, se necessário).
* Extração de RNA : Eles usariam técnicas padrão para extrair o RNA total do tecido hepático. Esse RNA incluiria mRNA e outros tipos de RNA.
* isolamento de mRNA: Eles então purificariam o mRNA usando uma técnica chamada Poly-A seleção. Esse processo explora o fato de que a maioria dos mRNAs tem uma cauda poly-A na extremidade de 3 '.

2. Criando uma biblioteca de cDNA

* Transcrição reversa: Usando transcriptase reversa, o cientista converteria o mRNA isolado em DNA complementar (cDNA). Este cDNA representa as seqüências de codificação dos genes expressos no fígado.
* clonagem : As moléculas de cDNA seriam clonadas em um vetor (por exemplo, um plasmídeo ou um bacteriófago) para criar uma biblioteca de cDNA. Esta biblioteca armazena essencialmente todos os genes expressos no fígado.

3. Identificando o gene de interesse

* sequenciamento de mRNA (RNA-seq): O cientista poderia sequenciar todos os mRNAs no fígado. Ao comparar as seqüências com um banco de dados de genes conhecidos, eles podem identificar o mRNA que codifica a proteína de interesse.
* Exibição diferencial ou análise de microarrays: Essas técnicas permitem que o cientista compare os padrões de expressão gênica no fígado (onde a proteína é produzida) com outros tecidos. Isso pode ajudar a identificar genes expressos especificamente no fígado.
* Triagem de anticorpos : Se a proteína já for conhecida, o cientista poderá usar anticorpos que se ligam especificamente à proteína para rastrear a biblioteca de cDNA. Isso identificará diretamente o clone de cDNA que codifica a proteína.

4. Expressão em células de sapo

* Clonagem do gene: O gene que codifica a proteína de interesse, agora identificado na biblioteca de cDNA, precisa ser isolado e clonado em um vetor que pode ser usado para entregá -lo em células de sapo.
* Escolha do vetor: O vetor deve conter os elementos regulatórios necessários (promotor, sinal de poliadenilação) para garantir que o gene seja transcrito e traduzido em células de sapo.
* transfecção/injeção: O vetor que contém o gene é introduzido em células de sapo. Existem diferentes métodos para isso:
* transfecção: Usando produtos químicos ou outros métodos para entregar o vetor em células de sapo cultivadas.
* Injeção : Injetar diretamente o vetor em embriões de sapo ou desenvolver tecidos.
* Verificação: O cientista precisará verificar se a proteína está sendo produzida nas células de sapo:
* imunofluorescência: Usando anticorpos fluorescentes para detectar a proteína dentro das células.
* Western blot: Usando anticorpos para detectar a proteína nos lisados celulares.
* Ensaios funcionais : Testando se a proteína possui a atividade biológica esperada nas células de sapo.

Considerações importantes:

* Diferenças de espécies: Embora o gene possa ser encontrado em uma espécie diferente, pode haver diferenças na maneira como é regulada ou expressa em sapos. Isso pode exigir ajustes ao vetor ou outras condições experimentais.
* Regulação do gene: O cientista precisará considerar os elementos regulatórios que controlam a expressão do gene no sapo. Isso pode diferir das espécies originais.
* preocupações éticas: Pesquisas envolvendo modelos animais requerem consideração cuidadosa de implicações éticas.

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