Western blotting é uma técnica poderosa usada para detectar proteínas específicas em uma amostra. Envolve a separação de proteínas com base em seu tamanho e, em seguida, o uso de anticorpos para direcionar e visualizar especificamente a proteína de interesse. Aqui está uma explicação passo a passo de como uma proteína específica pode ser detectada em um western blot:
1. Extração e preparação de proteínas: - O primeiro passo é extrair proteínas da amostra de interesse. Isto pode ser feito utilizando vários métodos, tais como lise celular ou homogeneização de tecidos, seguida de centrifugação para remover restos celulares.
- As proteínas extraídas são então quantificadas, normalmente utilizando um ensaio de Bradford ou métodos semelhantes, para garantir uma carga proteica igual nas etapas subsequentes.
2. Separação de proteínas: - A amostra de proteína é misturada com um tampão de carga contendo um agente redutor (por exemplo, beta-mercaptoetanol ou DTT) e um corante de rastreamento (por exemplo, azul de bromofenol).
- A mistura de proteínas é carregada num gel de poliacrilamida para eletroforese. O gel é submetido a uma corrente elétrica, fazendo com que as proteínas se separem de acordo com seu tamanho. Proteínas menores migram mais rapidamente através do gel, enquanto proteínas maiores se movem mais lentamente.
3. Transferência de proteínas: - Após a eletroforese, as proteínas separadas são transferidas do gel para uma membrana de nitrocelulose ou membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Este processo, conhecido como protein blotting ou eletroblotting, envolve colocar o gel e a membrana em um tampão de transferência e aplicar uma corrente elétrica.
- Como resultado, as proteínas são transferidas do gel para a membrana, criando uma réplica das proteínas separadas.
4. Bloqueio de membrana: - Para reduzir a ligação inespecífica de anticorpos, a membrana de nitrocelulose ou PVDF é bloqueada com uma solução contendo uma proteína como albumina de soro bovino (BSA) ou leite em pó desnatado.
- Esta etapa de bloqueio ajuda a minimizar os sinais de fundo e melhora a especificidade da ligação do anticorpo durante as etapas subsequentes.
5. Incubação primária de anticorpos: - A membrana é incubada com um anticorpo primário que reconhece e se liga especificamente à proteína de interesse. Os anticorpos primários são normalmente gerados contra a proteína alvo ou um epítopo específico dentro da proteína.
- Esses anticorpos são diluídos em tampão apropriado e incubados com a membrana, permitindo que se liguem às suas proteínas alvo.
6. Lavagem: - Após a incubação do anticorpo primário, a membrana é cuidadosamente lavada para remover os anticorpos não ligados e reduzir os sinais de fundo. Esta etapa de lavagem é crucial para garantir a detecção específica da proteína alvo.
7. Incubação de anticorpos secundários (conjugados com uma enzima repórter): - Um anticorpo secundário, conjugado a uma enzima como a peroxidase de rábano (HRP) ou a fosfatase alcalina (ALP), é usado para detectar os complexos anticorpo-antígeno primários na membrana.
- Os anticorpos secundários são específicos da espécie, o que significa que reconhecem e se ligam aos anticorpos primários produzidos numa espécie específica (por exemplo, ratinho ou coelho).
- O anticorpo secundário conjugado com enzima liga-se ao anticorpo primário, criando um complexo que permite a amplificação e visualização do sinal.
8. Lavagem: - Outra etapa de lavagem é realizada para remover anticorpos secundários não ligados e reduzir os sinais de fundo.
9. Detecção quimioluminescente: - Para anticorpos secundários conjugados com HRP, um substrato quimioluminescente é adicionado à membrana. Quando o substrato reage com o HRP, ele emite luz.
- Sistemas especializados de detecção de quimioluminescência ou filmes de raios X são usados para capturar e visualizar os sinais de luz emitidos. A intensidade da luz corresponde à quantidade da proteína alvo presente na amostra.
10. Análise e interpretação de dados: - O filme de raios X revelado ou as imagens digitais de quimiluminescência são analisados para identificar bandas ou manchas correspondentes à proteína alvo.
- O tamanho e a intensidade destas bandas podem fornecer informações sobre o peso molecular, abundância e modificações pós-traducionais da proteína detectada.
Seguindo estas etapas, o western blotting permite a detecção e análise específica de uma proteína de interesse em uma mistura complexa de proteínas. É amplamente utilizado em vários campos da pesquisa biológica, incluindo biologia molecular, imunologia e diagnóstico clínico.
