Diluindo a amostra
Antes que a suspensão celular possa entrar na câmara de contagem pode precisar de diluição porque pode conter milhares ou milhões de células. Nesse caso, as células não podem ser razoavelmente contadas. Para diluir a amostra, use uma pipeta estéril para colocar dez microlitros da solução celular em um tubo de ensaio contendo 90 microlitros de um diluente. O tipo de diluente dependerá do tipo de célula. Misture bem. Esta solução é agora dez vezes mais diluída do que a amostra inicial, pelo que o seu factor de diluição é 10 -1. Etiquete-o. Repita isso várias vezes, usando uma pipeta esterilizada, até a solução ficar suficientemente diluída. Se você diluísse uma segunda vez, o segundo tubo de teste era 100 vezes mais diluído que a solução inicial, então o fator de diluição era 10 -2 e assim por diante. Contando as células Pode ser necessário tentar várias diluições para determinar o fator de diluição correto para a câmara de contagem. Uma câmara de contagem é basicamente uma caixa muito pequena, clara e retangular com uma profundidade precisa e uma grade precisa inscrita na parte superior. Também é conhecido como hemocitômetro ou, às vezes, hemacitômetro. O objetivo é que a suspensão seja suficientemente diluída para que, quando vista na câmara de contagem, nenhuma célula se sobreponha e elas sejam distribuídas de maneira uniforme pela grade. Pipetar a suspensão diluída contendo as células para o poço na câmara de contagem, onde vai se estabelecer na câmara de grade através de ação capilar. Coloque a câmara de contagem no microscópio e veja-a sob baixa potência. A grelha contém quadrados que são feitos de quadrados ainda menores. Selecione aproximadamente quatro ou cinco quadrados, ou quantos você precisar contar pelo menos 100 células, em um padrão de sua escolha, como os quatro cantos e um quadrado central. Se as células forem grandes, elas podem ser os quadrados grandes, mas se as células forem pequenas, você pode escolher os quadrados menores. Calculando a concentração O volume específico de cada quadrado de grade pode variam de acordo com o fabricante da câmara de contagem, mas muitas vezes, a profundidade da câmara é de 0,1 milímetros, a área dos grandes quadrados é de 1 milímetro quadrado, e a área dos quadrados menores é de 0,04 milímetros quadrados. Os quadrados maiores, então, têm um volume de 0,1 milímetros em milímetros. Para este exemplo, suponha que você tenha contado um total de 103 células em cinco quadrados e que você tenha diluído a amostra inicial até o fator de diluição ter sido 10 -2. Se cada quadrado da grade tiver um volume de 0,1 milímetros cúbicos e cinco foram contados, em seguida, o volume total da câmara que foi contada foi de 0,5 milímetros cúbicos, e havia 103 células. Dobrado para torná-lo 1 milímetro cúbico faria 206 células. Um centímetro cúbico equivale a 1 mililitro, o que é uma medida útil para líquidos. Existem mil milímetros cúbicos em um centímetro cúbico. Portanto, se houvesse um centímetro cúbico, ou um mililitro de suspensão, você teria contado 206.000 (206 x 1.000) células. Isto é o que parece como uma equação: Volume do quadrado da grade × número de quadrados contados = volume total da suspensão contada Número de células ÷ volume da suspensão contada = contagem de células por milímetros Cubed Contagem de células por milímetro ao quadrado × 1000 = Contagem de células por mililitro Calculando a concentração não diluída pelo Você precisará contabilizar qualquer diluição realizada para tornar a solução inicial contável sob o microscópio. Neste exemplo, o fator de diluição é 10 -2. Para calcular a concentração inicial da solução: Contagem de células por mililitro ÷ fator de diluição = Concentração de células Para este exemplo, a contagem de células por mililitro é de 206.000 e dividindo por 10 -2 (0,01) fornece uma concentração de células de 20.600.000 células por mililitro na amostra inicial.
