A clonagem molecular é um método comum de biotecnologia com o qual todos os estudantes e pesquisadores devem estar familiarizados. Clonagem molecular usando um tipo de enzima chamada enzima de restrição para cortar DNA humano em fragmentos que podem então ser inseridos no DNA plasmidial de uma célula bacteriana. Enzimas de restrição cortam DNA de fita dupla ao meio. Dependendo da enzima de restrição, o corte pode resultar em uma extremidade pegajosa ou em uma extremidade cega. Extremidades pegajosas são mais úteis na clonagem molecular porque asseguram que o fragmento de DNA humano seja inserido no plasmídeo na direção correta. O processo de ligação, ou fusão de fragmentos de DNA, requer menos DNA quando o DNA tem extremidades aderentes. Por fim, múltiplas enzimas de restrição endémicas podem produzir a mesma extremidade adesiva, mesmo que cada enzima reconheça uma sequência de restrição diferente. Isso aumenta a probabilidade de sua região de interesse em DNA ser cortada por enzimas endócrinas.

Enzimas de restrição e locais de restrição

As enzimas de restrição são enzimas que cortam reconhecem sequências específicas em DNA de filamento duplo e cortar o DNA ao meio nessa sequência. A sequência reconhecida é chamada de site de restrição. As enzimas de restrição são chamadas de endonucleases porque elas cortam o DNA de fita dupla, que é como o DNA normalmente existe, em locais que estão entre as extremidades do DNA. Existem mais de 90 enzimas de restrição diferentes. Cada um reconhece um site de restrição distinto. Enzimas de restrição clivam seus respectivos sítios de restrição 5.000 vezes mais eficientemente do que outros sítios que eles não reconhecem.

A Orientação Correta

As enzimas de restrição vêm em duas classes gerais. Eles ou cortam DNA em pontas pegajosas ou pontas sem ponta. Uma extremidade pegajosa tem uma região curta de nucleotídeos, os blocos de construção do DNA, que não é pareado. Esta região não pareada é chamada de pendente. Diz-se que a saliência é pegajosa porque quer e será emparelhada com outra extremidade adesiva que tem uma sequência complementar saliente. As pontas pegajosas são como os gêmeos há muito perdidos que procuram se abraçar com força quando se encontram. Por outro lado, os extremos cegos não são pegajosos porque todos os nucleotídeos já estão emparelhados entre os dois filamentos de DNA. A vantagem das extremidades pegajosas é que um fragmento de DNA humano só pode se encaixar em um plasmídeo bacteriano em uma direção. Em contraste, se tanto o DNA humano quanto o plasmídeo bacteriano tiverem extremidades cegas, o DNA humano pode ser inserido cabeça-a-cauda ou cauda-a-cabeça no plasmídeo.

Ligando extremidades pegajosas requer menos DNA
Diferentes enzimas podem dar o mesmo fim pegajoso

Os locais de restrição estão localizados em todo o genoma dos organismos, mas não estão uniformemente espaçados. Em plasmídeos, eles podem ser projetados para estarem localizados próximos uns dos outros. Os cientistas que querem cortar um fragmento de DNA humano do genoma humano devem encontrar locais de restrição que estão na frente e atrás da região do fragmento. Além de garantir que um fragmento de DNA seja inserido na direção correta, diferentes enzimas de extremidade adesiva podem criar a mesma extremidade adesiva, mesmo que reconheçam diferentes seqüências de restrição. Por exemplo, BamHI, BglII e Sau3A possuem diferentes seqüências de reconhecimento, mas produzem a mesma extremidade adesiva do GATC. Isso aumenta a probabilidade de que existam locais de restrição final que envolvam seu gene humano de interesse.