A reação em cadeia da polimerase, ou PCR, é uma técnica que fotocopia um fragmento de DNA em muitos fragmentos - exponencialmente muitos. O primeiro passo é em PCR é aquecer o DNA para que ele desnature, ou derrete em cadeias simples. A estrutura do DNA é como uma escada de corda na qual os degraus são cordas com extremidades magnéticas. Os ímãs se conectam para formar os degraus, chamados de pares de bases, e assim resistem a serem separados. Cada fragmento de DNA se funde em cadeias simples a diferentes temperaturas. Entender como a estrutura do DNA é mantida unida pelas partes individuais do DNA dará uma ideia de por que diferentes fragmentos de DNA derretem a diferentes temperaturas e por que tais altas temperaturas são necessárias em primeiro lugar.
Derretendo! Derretendo!
O primeiro passo da PCR é fundir o DNA de modo que o DNA de fita dupla se separe em DNA de fita simples. Para DNA de mamíferos, este primeiro passo geralmente envolve calor de aproximadamente 95 graus Celsius (cerca de 200 Fahrenheit). A essa temperatura, as ligações de hidrogênio entre os pares de bases A-T e G-C, ou degraus na escada do DNA, se quebram, descompactando o DNA de fita dupla. No entanto, a temperatura não é quente o suficiente para quebrar o backbone de fosfato de açúcar que forma os fios simples, ou os polos da escada. A separação completa das fitas simples prepara-as para a segunda etapa da PCR, que é resfriada para permitir que pequenos fragmentos de DNA, chamados de primers, se unam às fitas simples. aquecido à alta temperatura de 95 graus Celsius é que quanto mais longa a fita dupla do DNA, mais ela quer ficar junto. O comprimento do DNA é um fator que afeta o ponto de fusão escolhido para a PCR naquele pedaço de DNA. Os pares de bases A-T e G-C na ligação de ADN de cadeia dupla entre si para manter a estrutura de cadeia dupla em conjunto. Os pares de bases mais consecutivos entre duas cadeias simples se uniram, quanto mais seus vizinhos também desejam se unir, e mais forte se torna a atração entre as duas cadeias. É como um zíper feito de pequenos ímãs. Quando você fecha o zíper, os imãs naturalmente vão querer fechar e ficar zipados. Ímanes mais fortes ficam mais firmes Outro fator que afeta qual temperatura de fusão escolher para seu fragmento de interesse de DNA é a quantidade de pares de bases GC presentes nesse fragmento. Cada par de bases é como dois mini-ímãs que atraem. Um par feito de G e C é muito mais fortemente atraído do que um par A e T. Assim, um pedaço de DNA que tem mais pares G-C do que outro fragmento exigirá uma temperatura mais alta antes de se fundir em filamentos simples. O DNA naturalmente absorve a luz ultravioleta - no comprimento de onda de 260 nanômetros, para ser exato - e o DNA de fita simples absorve mais luz do que o DNA de fita dupla. Então, medir a quantidade de luz absorvida é uma maneira de medir o quanto o seu DNA de fita dupla se fundiu em fios simples. O efeito "zíper magnético" dos pares de bases G-C e A-T é o que faz com que um gráfico da absorbância da luz do DNA de fita dupla representado por um aumento na temperatura seja sigmoidal, com a forma de um S e não uma linha reta. A curva do S representa a resistência do trabalho em equipe que os pares de bases exercem contra o calor porque não querem se separar. O Ponto Intermediário A temperatura na qual um comprimento de DNA derrete em fitas simples é chamada de temperatura de fusão, que é denotada pela abreviação “Tm”. Isso indica a temperatura na qual metade do DNA em uma solução derretia em fitas simples e a outra metade ainda está na forma de fita dupla. A temperatura de fusão é diferente para cada fragmento de DNA. DNA de mamíferos tem um teor de G-C de 40%, significando que os restantes 60% dos pares de bases são As e Ts. Seu conteúdo de 40% de G-C faz com que o DNA dos mamíferos derreta a 87 graus Celsius (cerca de 189 Fahrenheit). É por isso que o primeiro passo da PCR no DNA dos mamíferos é aquecê-lo a 94 graus Celsius (201 Fahrenheit). Apenas sete graus mais quentes que a temperatura de fusão e todos os filamentos duplos derreterão completamente em filamentos simples.
