Western blotting é um dos procedimentos mais comuns em laboratórios bioquímicos. Basicamente, separa as proteínas de uma amostra por tamanho, depois testa usando anticorpos para determinar se uma determinada proteína está presente. É útil não só em pesquisas, mas também em laboratórios médicos ou de diagnóstico; Testes para HIV e doença de Lyme, por exemplo, envolvem um ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA), seguido por um Western blot se o teste ELISA for positivo. Apesar de sua popularidade, no entanto, Western blotting tem várias desvantagens.
Nonquantitative
Western blots clássicos não são quantitativos. Em outras palavras, enquanto eles podem dizer aos pesquisadores se uma determinada proteína está presente, eles não tornam possível quantificar quanto da proteína está presente. Algumas empresas de biotecnologia agora vendem kits que permitem que pesquisadores ou técnicos de laboratório quantifiquem a quantidade de proteína presente usando uma curva padrão - mas isso só funciona se amostras puras da mesma proteína estiverem disponíveis. Além disso, o peso molecular de uma proteína só pode ser estimado com Western blotting, em vez de determinado precisamente como com a espectrometria de massa.
Anticorpos
Um Western blot só pode ser realizado se os anticorpos primários contra o proteína de interesse estão disponíveis. Embora anticorpos para muitas proteínas diferentes estejam disponíveis em empresas de biotecnologia, eles não são baratos; Se os anticorpos primários não estiverem disponíveis para uma determinada proteína, não será possível realizar um Western blot procurando essa proteína em particular. Além disso, os pesquisadores podem querer determinar se uma proteína foi modificada de alguma forma - se ela foi fosforilada (tinha um grupo fosfato ligado a ela), por exemplo - e com a técnica de Western blot eles precisam de anticorpos específicos para a proteína modificada. protein.
Treinamento
Pode ser um desafio realizar um Western blot apropriadamente e obter bons resultados, portanto a equipe deve ser bem treinada. Neste, como em muitos outros aspectos, a experiência talvez seja o melhor professor; Mesmo para um técnico experiente, no entanto, um Western blot é demorado. A porção de eletroforese em gel do experimento, por exemplo, normalmente leva de uma a duas horas para ser executada. Outras tarefas podem ser executadas enquanto o gel está em funcionamento, é claro, mas o experimento ainda leva algum tempo para obter resultados.
Outras limitações
Anticorpos podem às vezes exibir alguma ligação fora do alvo, o que pode resultar em resultados mais pobres. Além disso, com o Western blotting, você usa um anticorpo contra uma proteína específica, portanto, seus resultados só lhe dirão se essa proteína estava presente. A espectrometria de massa de alta resolução, por contraste, revela todas as proteínas presentes em uma amostra e, ao contrário do Western blotting clássico, é quantitativa. É importante lembrar, é claro, que a espectrometria de massa é muito mais cara e tecnicamente mais desafiadora do que a do Western blotting.
