Em eletroforese em gel, amostras de DNA ou proteínas são separadas - geralmente com base no tamanho - pela aplicação de um campo elétrico que faz com que elas migrem através de um gel. O uso de eletroforese em gel é rotineiro em laboratórios de pesquisa biomédica e é usado para responder a uma variedade de questões diferentes, portanto, não há realmente uma maneira universal de analisar os resultados. Diferentes técnicas, como Western blotting, Northern blotting e Southern blotting, por exemplo, envolvem eletroforese em gel. Se você estiver fazendo eletroforese em gel de agarose de amostras de DNA, o tipo mais comum de procedimento, você normalmente precisará fazer pelo menos duas coisas: 1) distinguir plasmídeos não cortados de inserções, cortar plasmídeos e cortar plasmídeos e 2) estimar o tamanho dos vários fragmentos de DNA. Veja como funciona.
Verifique seu caderno de anotações para determinar quais amostras foram carregadas em quais faixas. Quando você carregou os poços para o seu gel, você deve ter anotado a identidade de cada pista /amostra.
Determine qual pista contém a "escada" dos padrões de DNA. Estes são fragmentos de comprimento conhecido; sua distância de migração pode ser usada para determinar o tamanho dos fragmentos de amostra.
Usando uma régua, meça a distância em sua foto dos poços até a tinta de rastreamento, que terá viajado mais longe do que qualquer uma das bandas de DNA. (em outras palavras, será no fundo do gel). Grave este número - as unidades que você usa não são importantes.
Meça a distância da sua imagem dos poços para cada uma das bandas na "escada", então divida essa distância pela distância percorrida pela distância. faixa de corante de rastreamento. Esse cálculo fornece a mobilidade relativa de cada banda.
Exemplo: suponha que a faixa de corante de rastreamento tenha percorrido 6 polegadas e tenhamos três bandas que percorreram 5, 4,5 e 3,5 polegadas. Qual é a sua mobilidade relativa? Resposta: Nós dividimos 5, 4,5 e 3,5 por 6 para obter mobilidades relativas de 0,833, 0,75 e 0,5833.
Insira as mobilidades relativas em seu programa de planilhas (Excel ou qualquer outro programa similar que você use) tamanho em kilobases de cada fragmento na escada. (O fabricante fornece o tamanho de cada fragmento nas escadas que eles fornecem, portanto você já deve ter essa informação.)
Represente graficamente os dados com mobilidade relativa no xe tamanho em kilobases no y. >
Use a função Trendline no seu programa de planilhas para ajustar uma equação aos dados. Essa equação deve ser uma equação de poder (por exemplo x ^ -2) e deve ajustar os dados relativamente bem (coeficiente R de pelo menos 0,9).
Veja as bandas correspondentes às suas amostras. Lembre-se que fragmentos menores de DNA viajam mais longe através do gel do que grandes fragmentos de DNA, então os mais próximos do corante de rastreamento serão os menores. Observe, no entanto, que se o DNA do plasmídeo (circular) não estiver cortado, ele se tornará "superenrolado" ou torcido como um fio telefônico, o que na verdade fará com que ele viaje MAIS DO que o DNA linear do mesmo tamanho. Da mesma forma, um plasmídeo "cortado" que tenha sido incompletamente cortado percorrerá uma distância SHORTER em relação ao DNA linear do mesmo tamanho. Conseqüentemente, você não pode estimar o tamanho dos plasmídeos não cortados do seu gel.
Combine as faixas em cada pista com a identidade da amostra que você carregou nessa pista e determine se o que você vê é o que você esperaria . Isso dependerá da natureza do seu experimento. Em geral, no entanto, se você digeriu um plasmídeo de inserção com duas enzimas de restrição, você esperaria que a inserção fosse liberada do plasmídeo; como é muito menor que o plasmídeo, você esperaria ver duas faixas nessa faixa, uma próxima ao topo e outra abaixo do final. Um plasmídeo cortado com apenas uma enzima de restrição deve formar apenas uma única banda que percorre um pouco mais do que o plasmídeo cortado com duas enzimas de restrição, mas nem de longe perto da inserção.
Meça a distância entre os poços o plasmídeo cortado e insira as bandas com sua régua. Divida esses números pela distância percorrida pelo corante de rastreamento para encontrar a mobilidade relativa das inserções e corte de plasmídeos.
Conecte a mobilidade relativa das inserções e corte os plasmídeos na equação que seu programa de planilha calculou para você. Esse cálculo deve dar uma estimativa do tamanho desses plasmídeos.
Dica
Se você vir faixas largas e brilhantes no fundo de cada pista, provavelmente tem um pouco de RNA no seu gel. - seu protocolo de purificação pode ser falho.
