DNA recombinante (o ácido desoxirribonucleico é um tipo sintético de ácido nucléico criado pela união de seqüências de DNA que não existiriam naturalmente em circunstâncias normais e condições ambientais. O processo de fabricação de DNA recombinante é feito por um procedimento avançado em biologia e genética conhecido como clonagem gênica.O DNA recombinante é colocado em uma célula, que então produz uma proteína completamente nova, e é usada para sintetizar drogas, anticorpos ou proteínas específicas apenas para pesquisa.
Introdução
O DNA de um organismo doador ou fonte biológica é primeiro extraído das células e então submetido a um processo de corte conhecido como restrição enzimática, o que gera fragmentos de DNA que contêm o gene ou genes de interesse. "clonados" (ou seja, inseridos) ou presos em fragmentos do organismo receptor. Eles são inseridos em moléculas de DNA maiores ("plasmídeos"), que são colocados em uma bactéria e deixados multiplicar. O DNA recombinante é então recuperado e verificado.
Isolamento do DNA
O DNA deve primeiro ser extraído e purificado de outras moléculas celulares, como os ácidos ribonucléicos (RNAs), proteínas e estruturas, tais como células membranas. Para fins de clonagem, o DNA é obtido do núcleo e é conhecido como "DNA genômico". Um método comum para extração de DNA é a ultracentrifugação de componentes celulares em um gradiente de densidade composto de brometo de etídio em cloreto de césio. Alternativamente, uma série de lavagens com tampões alcalinos e salinos também pode ser usada para recuperar o DNA. Uma vez que este é precipitado e limpo de todos os outros contaminantes indesejáveis, o DNA pode ser cortado em fragmentos.
Digestão Enzimática por Restrição de DNA
Enzimas de restrição são enzimas que cortam seqüências de DNA muito específicas; eles são usados para criar fragmentos de DNA únicos. Este processo assegura que não sejam geradas sequências imprecisas, incorretas ou indesejadas e que sejam acidentalmente incorporadas no ADN recombinante final, o que pode resultar em falha experimental e morte celular. Para gerar os fragmentos de DNA desejados, uma única (ou combinação de) enzima (s) específica é usada para cortar ou digerir o DNA. Os fragmentos são então purificados por eletroforese em gel, que os separa do DNA indesejado. Um método mais simples envolve simplesmente o cisalhamento mecânico, que retira os segmentos de DNA mais longos em segmentos menores que podem ser usados para clonagem.
Ligação de DNA
Ligação é o processo de colar ou unir o doador e receptor (ou vector) fragmentos de DNA para criar uma molula de DNA recombinante. Idealmente, as enzimas de restrição escolhidas para criar os fragmentos teriam sido cuidadosamente pensadas e projetadas de tal forma que permitissem que esses fragmentos fossem colocados juntos como um quebra-cabeça. Para fazer isto, as enzimas de restrição que produzem "extremidades coesivas" compatíveis são preferidas, de tal modo que todos os fragmentos compatíveis se juntarão naturalmente uns com os outros; caso contrário, a enzima DNA ligase pode ser usada para unir os segmentos de DNA com ligações fosfodiéster.
Replicação de DNA recombinante
O processo de transformação ou choque térmico é usado para colocar a molécula de DNA recombinante em um célula bacteriana hospedeira, que pode gerar muitas cópias do DNA sintético. Essas bactérias são cultivadas em placas de ágar, cultivadas em caldos especiais de bactérias e depois lisadas para liberar o DNA recombinante. Finalmente, o DNA pode ser verificado por sequenciamento de DNA, experimentos funcionais e digestão por enzimas de restrição.
