CRONT:Capacitando pinças ópticas com olhos biométricos
a, O esboço diagramático dos três componentes na solução:conjugado DNA@AuNS, complexo CRISPR/Cas12a e ssDNA alvo. b, configuração óptica, BS, SPF e TL são divisor de feixe, filtro passa curto e lente tubular (f =200 mm), respectivamente. Detalhes adicionais da configuração são fornecidos na seção Materiais e Métodos. c, Dispersão dos três componentes na solução sem aquecimento óptico. d, Força resultante optotérmica (FRede ) migração induzida e clivagem do conjugado DNA@AuNS após aquecimento óptico, a potência do laser de aquecimento é de 0,5 mW. e, Observação da clivagem após o desligamento do aquecimento óptico. Crédito:Jiajie Chen, Zhi Chen, Changle Meng, Jianxing Zhou, Yuhang Peng, Xiaoqi Dai, Jingfeng Li, Yili Zhong, Xiaolin Chen, Wu Yuan, Ho-Pui Ho, Bruce Zhi Gao, Junle Qu, Xueji Zhang, Han Zhang &Yonghong Shao As nanopinças optotérmicas, uma técnica inovadora de manipulação óptica na última década, revolucionaram a manipulação óptica clássica ao capturar eficientemente um espectro mais amplo de nanopartículas. Embora esta técnica tenha sido usada principalmente para manipulação in-situ de nanopartículas, o seu potencial para identificar bio-nanopartículas permanece largamente inexplorado.
Aqui, com base nos efeitos sinérgicos da manipulação optotérmica e da biodetecção baseada em CRIPSR, os autores desenvolveram nanopinças optotérmicas alimentadas por CRISPR (CRONT). Especificamente, aproveitando a difusioforese e os fluxos termo-osmóticos próximos ao substrato após a excitação optotérmica, os autores capturaram e enriqueceram com sucesso bio-nanopartículas, incluindo nanopartículas de ouro, proteínas associadas ao CRISPR, bem como moléculas de DNA.
Em uma publicação recente publicada em Light:Science &Applications , uma equipe de cientistas liderada pelo professor Jiajie Chen, Zhi Chen, Zhang Han, Yonghong Shao da Universidade de Shenzhen, juntamente com seus colaboradores, o professor Ho-Pui Ho da Universidade Chinesa de Hong Kong, desenvolveram uma abordagem optotérmica para melhorar a tecnologia baseada em CRISPR. detecção de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) para atingir o nível de molécula única.
Além disso, eles introduziram uma nova metodologia CRISPR para observar a clivagem de nucleotídeos. Além disso, esta abordagem inovadora dotou as pinças ópticas com capacidade de identificação de DNA em solução aquosa, o que antes era inatingível. Dada a sua notável especificidade e viabilidade para manipulação e identificação in-situ de bio-nanopartículas, está prestes a tornar-se uma ferramenta universal em diagnóstico no local de atendimento, biofotônica e bio-nanotecnologia.
O CRONT pode ser perfeitamente ajustado para manipular bio-nanopartículas e atender às condições de trabalho de identificação de bio-nanopartículas alvo baseadas em CRISPR. Especificamente, ao incorporar força difusioforética induzida por optotermia, os autores manipularam com sucesso bio-nanopartículas, incluindo ssDNA, dsDNA, BSA, proteína Cas12a e nanopartículas de ouro funcionalizadas com DNA.
Ao incorporar uma abordagem de biossensor de DNA baseada em CRISPR, na qual a clivagem de um único conjugado DNA@Gold-nanopartícula preso é interrogada, os autores transformaram esta pinça optotérmica em uma sonda molecular para as moléculas de DNA in-situ (SARS-CoV-2 ou Monkeypox) sem amplificação de ácido nucleico e atingiu limites de detecção de 25 aM para ssDNA e 250 aM para dsDNA. a, Um único DNA@AuNS é capturado pelo CRONT na região de aquecimento do laser. O laser de aquecimento é desligado aos 28,8s e a clivagem é observada posteriormente. b, Medições de rigidez de captura em diferentes potências do laser na direção x/y, com a linha tracejada denotando a rigidez máxima em 0,5 mW. c, Distribuição de posição do DNA único aprisionado@AuNS a 0,5 mW. d, Variação da intensidade da luz de um DNA aprisionado durante a ativação do laser. O ssDNA alvo é parte da sequência do vírus Monkeypox (MP). Os quadros foram registrados usando microscopia de campo escuro e a barra de escala é de 2 μm. e, Probabilidade de clivagem do DNA@AuNS em diferentes concentrações alvo de ssDNA (MP). f, Probabilidade de clivagem em diferentes grupos de combinação de crRNA e ssDNA alvo (A-E) para teste de especificidade, as concentrações alvo de ssDNA são 250 fM. g, Probabilidade de clivagem do DNA@AuNS em diferentes concentrações alvo de dsDNA (MP). A potência óptica definida como 0,5 mW em a, c-g. h, Probabilidade de clivagem do DNA@AuNS sob dsDNA a uma potência óptica inferior de 0,16 mW, a inserção indica a distribuição de temperatura. Cada evento de captura foi realizado durante 2 minutos e cada ponto de dados compreendeu de 10 a 17 eventos de captura durante um período de 40 minutos. Cada concentração foi testada três vezes. A fração de massa de PEG é de 10%. A concentração de AuNS e Cas12a é 0,5 μM e 0,125 nM, respectivamente. Crédito:Jiajie Chen, Zhi Chen, Changle Meng, Jianxing Zhou, Yuhang Peng, Xiaoqi Dai, Jingfeng Li, Yili Zhong, Xiaolin Chen, Wu Yuan, Ho-Pui Ho, Bruce Zhi Gao, Junle Qu, Xueji Zhang, Han Zhang &Yonghong Shao Notavelmente, eles demonstraram que essas nanopinças oferecem identificação de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) em volumes de detecção ultrabaixos (10 μL), que desempenham um papel crucial na diversidade genética e estão associados a vários traços fenotípicos, incluindo suscetibilidade a doenças e resposta a medicamentos. Portanto, esta inovação nas técnicas de detecção de SNP é essencial para atender às diversas demandas da pesquisa genômica e das aplicações médicas no futuro.
Esses autores resumiram o trabalho e as perspectivas do CRONT da seguinte forma:
"O CRONT permitiu a implementação imediata do biossensor baseado em CRISPR em um volume de detecção ultrabaixo. As pinças ópticas agora são dotadas de capacidade de identificação de DNA por meio do sistema de biossensor baseado em CRISPR. As propriedades de aquecimento localizadas do CRONT forneceram não apenas um caminho para a biomolécula enriquecimento, mas também um ambiente térmico necessário para a clivagem do complexo CRISPR."
"O desenvolvimento adicional deste esquema de biodetecção CRISPR baseado em optotérmica pode envolver a utilização de uma série de pontos de aquecimento a laser para detecção paralela de alto rendimento, o que torna a técnica mais adequada para detecção quantitativa e reduzindo significativamente o tempo de detecção. CRONT também pode ser empregado para guiar o complexo CRIPSR/Cas até o DNA alvo e iniciar o processo de edição genética. Também permite que os pesquisadores monitorem o processo de edição genética em tempo real no nível de molécula única", acrescentaram.
"Prevemos que essas nanossondas sem contato contribuirão para uma compreensão mais profunda de vários processos biológicos complexos, destacando semelhanças ópticas, térmicas e biológicas no nível de partícula única."
Mais informações: Jiajie Chen et al, nanopinças optotérmicas alimentadas por CRISPR:manipulação diversificada de bio-nanopartículas e identificação de nucleotídeo único, Light:Science &Applications (2023). DOI:10.1038/s41377-023-01326-9 Fornecido pela Academia Chinesa de Ciências
