A membrana que envolve uma célula biológica não é simplesmente uma barreira; está repleto de proteínas envolvidas em todos os tipos de funções biológicas críticas. Para realmente entender o que as proteínas da membrana estão fazendo e como, os pesquisadores precisam saber como elas estão organizadas e como interagem umas com as outras. Mas descobrir essas informações é um desafio.



Os pesquisadores de Yale desenvolveram agora um novo método de microscopia chamado Native-nanoBleach que supera os principais desafios para a compreensão da organização das proteínas da membrana, incluindo a dificuldade em estudar essas membranas sem perturbar o ambiente nativo e os limites da resolução dos microscópios de luz normalmente usados ​​para estudá-las.

E para demonstrar a eficácia do novo método, aplicaram-no com sucesso a um enigma biológico – relativo às proteínas envolvidas no desenvolvimento de cancros do pâncreas e como podem ser alvo de tratamento – que permaneceu sem solução durante décadas.

Eles descrevem o novo método e suas vantagens em um novo estudo publicado na Nature Nanotechnology .

Os métodos normalmente usados ​​no estudo da organização das proteínas da membrana exigem a remoção do ambiente de membrana nativo que envolve as proteínas e, em seguida, a colocação de proteínas isoladas de interesse em ambientes que imitam, mas não reproduzem totalmente a complexidade da membrana celular real, disse Moitrayee Bhattacharyya, professor assistente de farmacologia. na Escola de Medicina de Yale e autor sênior do estudo. Esta abordagem, disse Bhattacharyya, remove um contexto importante, uma vez que as proteínas interagem com as moléculas que as rodeiam.

Em segundo lugar, os microscópios ópticos, que são comumente usados ​​para observar a organização das proteínas, não têm a resolução necessária para determinar se as proteínas próximas umas das outras estão realmente interagindo ou são simplesmente vizinhas nas membranas.

Por último, a quantidade de uma determinada proteína encontrada numa membrana celular pode ser demasiado baixa ou demasiado elevada para os métodos actuais de estudo. Nesses casos, os investigadores têm de fazer ajustes; eles precisam replicar proteínas que em seu estado natural são muito poucas ou separar proteínas de amostras onde há muitas. Mas isto novamente pode remover um contexto importante sobre o estado natural das proteínas à medida que elas se assentam e funcionam nas membranas celulares.

“Idealmente, teríamos um método que funcionasse com qualquer nível endógeno de expressão de proteínas da membrana celular”, disse Bhattacharyya.

Para enfrentar o primeiro desafio, os pesquisadores usaram moléculas específicas, tipos de polímeros, para essencialmente perfurar complexos proteicos com a membrana celular circundante intacta. “É como se a membrana celular fosse uma folha de massa de biscoito e os polímeros fossem cortadores de biscoitos”, disse Bhattacharyya.

Esses pedaços de proteína com membrana celular circundante, chamados de nanodiscos nativos, têm aproximadamente 10 nanômetros de diâmetro, pequenos o suficiente para que quaisquer proteínas contidas no nanodisco provavelmente interajam, o que aborda o segundo desafio. Além disso, esta abordagem funciona com qualquer proteína da membrana celular em qualquer quantidade, permitindo aos investigadores observar proteínas nos seus níveis naturais nas membranas nativas.

Depois que os nanodiscos são gerados, os pesquisadores podem usar diversas técnicas comumente usadas para aprimorar uma proteína específica de interesse. Eles então quantificam as proteínas em cada nanodisco com a ajuda de moléculas fluorescentes ligadas a eles.

É uma abordagem que oferece alta resolução espacial sem a necessidade de hardware especializado, disse Bhattacharyya.

"Este trabalho apresenta uma nova técnica para entender como as proteínas da membrana - que representam cerca de 60% dos alvos dos medicamentos - se reúnem em unidades funcionais na ou dentro da bicamada lipídica nativa", disse Gerard Walker, coautor do artigo e estudante de pós-graduação. no laboratório de Bhattacharyya.

Para demonstrar como este método pode ser aplicado, os pesquisadores iniciaram um debate de décadas em biologia. Uma proteína chamada KRas sofre mutação em mais de 90% dos cânceres de pâncreas humanos, despertando imenso interesse clínico e terapêutico. Se as subunidades KRas se unem para formar dímeros (duas unidades) ou oligômeros (mais de duas unidades) nas membranas celulares, continua sendo o foco de investigações de longa data.

Estudos, no entanto, produziram resultados conflitantes. Estudos animais e celulares, que carecem de resolução molecular detalhada, mostram evidências de que as unidades KRas se unem nas membranas celulares. Enquanto isso, análises biofísicas, que não retêm a membrana nativa ao redor das proteínas, encontraram restos de KRas em unidades únicas, ou monômeros.

“Com o nosso método, obtemos o melhor dos dois mundos”, disse Bhattacharyya. "Mantemos o ambiente de membrana nativo e temos uma resolução espacial e de molécula única muito alta. Quando aplicamos nosso método, descobrimos que os KRas existem como dímeros e monômeros em quantidades semelhantes. Mas quando o KRas sofre mutação, como nos cânceres de pâncreas, os dímeros aumentam e os monômeros diminuem."

A descoberta destaca a importância da membrana celular nativa para a compreensão das proteínas da membrana e identifica um alvo – a redução da dimerização de KRas – para o tratamento do câncer. Esta é apenas uma das muitas maneiras pelas quais esse método pode ser usado para compreender o papel da organização das proteínas da membrana nas doenças, disse Bhattacharyya.

"É realmente gratificante ver o Native-nanoBleach já sendo aplicado com sucesso a uma ampla variedade de questões biológicas urgentes no laboratório Bhattacharyya e além", disse Caroline Brown, coautora do estudo e Ph.D. candidato no laboratório do coautor Kallol Gupta, professor assistente de biologia celular.

As proteínas da membrana constituem um terço de todas as proteínas do corpo humano e esta abordagem pode ser usada para estudar qualquer uma delas, disse Bhattacharyya.

“É uma técnica geral”, disse ela. "Não há realmente nenhuma limitação."

No futuro, Bhattacharyya e seus colegas esperam estender esta abordagem ao estudo da organização das proteínas nas membranas de várias organelas, estruturas, como as mitocôndrias, que estão contidas nas células.

Mais informações: Gerard Walker et al, Organização oligomérica de proteínas de membrana de membranas nativas em nanoescala espacial e resolução de molécula única, Nature Nanotechnology (2023). DOI:10.1038/s41565-023-01547-4
Informações do diário: Nanotecnologia da Natureza

Fornecido pela Universidade de Yale