p Uma nova passagem pelo cérebro da mosca permite que qualquer pessoa passe por neurônios e visite qualquer uma das 40 milhões de sinapses onde os neurônios tocam os neurônios. É uma visão de super-resolução das conexões de rede complexas no cérebro do inseto que sustentam comportamentos que vão desde a alimentação ao acasalamento. p O que é sem precedentes, Contudo, é que este mapa 3-D sobre todo o cérebro da mosca, que mostra detalhes tão pequenos quanto 60 nanômetros, foi capturado em menos de três dias.

p Embora o nível de detalhe não seja tão bom quanto o obtido com um microscópio eletrônico, esforços para mapear completamente os neurônios e sinapses do cérebro da mosca com EM levaram 10 anos e os esforços de dezenas de pessoas. O novo mapa foi obtido mil vezes mais rápido, combinando duas técnicas de ponta, microscopia de expansão e microscopia de folha de luz de rede.

p Um mapa em escala precisa da rede neural completa do cérebro - o cérebro humano, mas também o do rato e da mosca - tem sido o sonho dos neurocientistas há décadas. Com isso, eles poderiam rastrear as conexões entre os neurônios para entender como o cérebro toma decisões. E contando sinapses, neurocientistas poderiam julgar a força das conexões neurais, como os responsáveis ​​pela memória.

p A nova e mais rápida técnica de imagem do cérebro inteiro ajudará os cientistas a descobrir os circuitos neurais da mosca que, em última análise, também são a base do funcionamento do cérebro humano. E funciona igualmente bem para mapear os circuitos neurais em pequenos pedaços do cérebro do rato, e potencialmente o cérebro humano.

p "Você pode passar anos e anos obtendo uma imagem EM do cérebro de uma mosca, "disse o Prêmio Nobel Eric Betzig, que inventou o microscópio de folha de luz treliça enquanto estava no Campus de Pesquisa Janelia do Howard Hughes Medical Institute e agora é professor de biologia molecular e celular e de física na Universidade da Califórnia, Berkeley. "Posso nos ver chegando ao ponto de obter imagens de pelo menos 10 cérebros de mosca por dia."

p Essa velocidade e resolução permitirão que os cientistas façam novas perguntas, ele disse, como a diferença entre os cérebros de homens e mulheres, ou como os circuitos cerebrais variam entre as moscas do mesmo tipo.

p "Cruzamos um limiar em desempenho de imagem, "disse Edward Boyden, do Instituto de Tecnologia de Massachusetts, que inventou a microscopia de expansão há cinco anos. "É por isso que estamos tão animados. Não estamos apenas escaneando cada vez mais o tecido cerebral, estamos examinando cérebros inteiros. "

p Betzig, Boyden e suas equipes publicarão suas descobertas esta semana no jornal Ciência .

p Combinando expansão e microscopia de folha de luz

p A nova técnica de varredura cerebral surgiu depois que Boyden pediu a ajuda de Betzig para combinar a microscopia de expansão com a mais recente técnica de imagem de alta velocidade de Betzig, microscopia de lâmina de luz em rede. A microscopia de expansão (ExM) envolve a fixação do tecido e a expansão como um balão, mantendo as posições relativas das estruturas internas inalteradas. Ele usa um gel de poliacrilamida como o das fraldas, que incha quando passa de água salgada para água pura. A microscopia de folha de luz reticulada (LLSM) usa feixes de luz altamente focados para montar rapidamente uma imagem 3-D de um espécime, uma fatia fina de cada vez.

p "Quando eles me procuraram pela primeira vez em 2016, Eu ainda era um cético; Eu estava preocupado, primeiro, se você poderia expandir algo assim e não ser distorcido como um louco, "Betzig disse." E então eu estava com medo de que, enquanto as amostras são transparentes, eles ainda distorceriam a luz como um saco de bolinhas de gude. "

p Trabalhando no campus Janelia, as equipes combinadas, liderado pelos pós-doutorandos Ruixuan Gao e Shoh Asano do laboratório MIT de Boyden e Srigokul Upadhyayula da Harvard Medical School, descobriram que depois de expandir o tecido cerebral por um fator de quatro, a um volume 64 vezes o normal, era quase tão claro quanto a água e não empenado.

p "Fiquei chocado com a forma como a clareira era perfeita para torná-la incrivelmente uniforme opticamente, " ele disse.

p Como resultado, o microscópio de folha de luz de rede foi capaz de produzir uma imagem altamente detalhada e precisa do cérebro no nível de sinapses simples:uma resolução de cerca de 60 nanômetros, que é apenas um décimo da resolução do EM. A imagem multicolorida levou apenas 62,5 horas.

p As equipes testaram a técnica ExLLSM não apenas em todo o cérebro da mosca-das-frutas, mas também em uma lasca de cérebro de camundongo que mede o córtex de um milímetro de espessura, com resultados semelhantes. Eles foram capazes de contar todas as sinapses no cérebro da mosca, totalizando cerca de 40 milhões. O cérebro humano, com 80 bilhões de neurônios e talvez 7, 000 sinapses por neurônio, seria muito mais desafiador.

p Betzig prevê, Contudo, que com as melhorias na microscopia de expansão - alguns cientistas esticaram o tecido 25 vezes em cada direção - as técnicas combinadas poderiam alcançar resultados quase tão bons quanto o EM em termos de mapeamento de todas as conexões neurais no cérebro, um campo conhecido como conectômica.

p "Se você pudesse fazê-lo funcionar com uma expansão de 10 vezes ou talvez 15 vezes, você provavelmente poderia colocar muitos EM fora do mercado, "disse ele." Pode ser bom o suficiente para fazer o rastreamento neural denso que o EM pode fazer, mas muito mais rápido e barato. Eu acho que eles precisam cuidar de suas costas. Ainda não está aí, mas na minha opinião, o potencial está aí. "

p Microscópio Fluorescente

p Ambas as técnicas de microscópio envolvem a marcação de proteínas no tecido com marcadores fluorescentes. Na microscopia de expansão, o tecido é então infundido com o gel e os marcadores reticulados à estrutura do gel. Então, toda a proteína é digerida, deixando o que Betzig chama de "fantasma fluorescente". Alterar a concentração de sal da mídia faz com que o gel inche, arrastando os marcadores com ele. Torna-se principalmente água, o que explica sua clareza.

p Boyden originalmente usou microscopia de luz confocal para obter imagens do tecido expandido, mas ele esperava que o LLSM gerasse a imagem da amostra mais rápido e com resolução ainda melhor, ao mesmo tempo em que supera a perda completa do sinal de fluorescência que ocorre ao obter imagens bem no fundo de espécimes espessos por meios convencionais. LLSM faz a varredura de uma folha de luz tão estreita quanto 400 nanômetros, plano a plano através da amostra, imagiologia da fluorescência dos marcadores em cada plano iluminado

p Cada varredura completa, totalizando quase 10 terabytes de dados, é então montado pelo computador em uma imagem 3-D que pode ser navegada como um videogame. A montagem demorada foi supervisionada pelos cientistas da computação da Janelia Stefan Saalfeld e Igor Pisarev, e então analisado e visualizado por Upadhyayula, que em breve abrirá um laboratório de imagem de última geração na UC Berkeley.

p Ao anexar marcadores fluorescentes a qualquer um dos 10, 000 proteínas no cérebro, deve ser possível mapear as membranas externas dos neurônios e outras células, as sinapses onde um neurônio se conecta com outro, os compartimentos internos das células cerebrais, e muito mais.

p Existem limitações, Contudo. Como acontece com qualquer tipo de microscopia de fluorescência de super-resolução, Betzig disse, pode ser difícil decorar proteínas com lâmpadas fluorescentes suficientes para vê-las claramente em alta resolução. E uma vez que a microscopia de expansão requer muitas etapas de processamento, ainda há o potencial de introdução de artefatos. Por causa disso, ele disse, "trabalhamos muito para validar o que fizemos, e outros fariam bem em fazer o mesmo. "