p O sequenciamento rápido de DNA pode em breve se tornar uma parte da rotina do registro médico de cada indivíduo, fornecendo enormes informações previamente sequestradas nas 3 bilhões de bases de nucleotídeos do genoma humano. Seção NEWSFOCUS desta semana do jornal Ciência descreve avanços recentes na tecnologia de sequenciamento. p Stuart Lindsay, diretor do Centro de Biofísica de Molécula Única do Instituto Biodesign, está na vanguarda desta pesquisa, tendo abordado com sucesso um obstáculo central no sequenciamento de nanopore - a leitura de bases de nucleotídeo único em uma cadeia de DNA. Os últimos resultados experimentais de Lindsay, que demonstram melhorias críticas nas leituras de DNA, acabaram de aparecer no jornal Nanotecnologia .

p Uma vez que o sequenciamento preciso cai abaixo do limite de $ 1, 000 por genoma, a tecnologia deve se tornar onipresente, de acordo com muitos. Como sugere a visão geral da ciência atual, esse dia pode estar se aproximando à medida que a velocidade e o custo de todo o sequenciamento do genoma avançam a um ritmo que ultrapassa a famosa Lei de Moore, (o que dita uma duplicação da capacidade de computação - e redução da despesa pela metade - a cada 18 meses).

p A mais recente competição tecnológica envolve a ideia de enfiar uma única fita de DNA por meio de um minúsculo, ilhó em escala molecular conhecido como nanoporo. Esta estratégia pode em breve permitir que toda a sequência de DNA seja lida de uma só vez, ao invés de cortar, decifrado em breves fragmentos e meticulosamente remontado.

p Embora o primeiro sequenciamento do genoma humano levasse aos pesquisadores 13 anos e US $ 3 bilhões para ser alcançado, sob os auspicios do Projeto Genoma Humano, o feito pode ser realizado em breve na taxa de cegamento de 6 bilhões de bases de nucleotídeos a cada 6 horas a um custo de $ 900. Pelo menos essa é a afirmação extravagante feita pela Oxford Nanopore Technologies, uma das empresas pioneiras em novos desenvolvimentos de sequenciamento.

p Uma vez que a ideia aparentemente quixotesca de sequenciamento de nanoporos foi concebida pela primeira vez em meados de 1990, enormes avanços foram feitos. A ideia básica é que quando um nanoporo está imerso em um fluido condutor e uma voltagem é aplicada a ele, a condução de íons através do nanoporo produzirá uma corrente elétrica mensurável. Esta corrente é altamente sensível ao tamanho e forma do nanopore e, em teoria, cada base de nucleotídeo no segmento de DNA obstruirá o nanopore conforme ele migra, alterando a corrente iônica de uma forma reconhecível e reproduzível.

p O “fio” de DNA é um material complicado de manipular, no entanto - tão fino que seriam necessários cerca de 5.000 fios de DNA colocados lado a lado para igualar a largura de um cabelo humano. Apenas encontrar um orifício adequado nesta escala foi um desafio. Inicialmente, poroso, proteínas transmembrana foram exploradas. Alfa hemolisina (αHL), uma bactéria que causa a lise dos glóbulos vermelhos, parecia um candidato particularmente promissor, dado o diâmetro do nanoporo necessário para o sequenciamento do DNA.

p Desde então, outros portais baseados em proteínas para DNA foram modificados e, mais recentemente, vários nanoporos de "estado sólido" de silício ou grafeno foram investigados. Estes podem ser mais facilmente fabricados e suas propriedades, controlado com mais precisão.

p De acordo com a revisão da Science do atual estado da arte, sequenciamento de nanopore "parece prestes a deixar o laboratório, ”E o sonho de um genoma de $ 1000 pode estar próximo, embora os desafios permaneçam. Um problema persistente no sequenciamento de bases individuais é que elas tendem a fluir através do nanoporo muito rapidamente para localizar cada base independentemente. Em vez de, a corrente medida nos primeiros experimentos refletia a média produzida por um grupo de bases abrindo caminho através do túnel.

p A técnica de Lindsay se baseia na leitura da corrente elétrica em um minúsculo circuito composto de um nucleotídeo de DNA preso entre um par de eletrodos de ouro, que abrange um nanopore. Os eletrodos são feitos funcionalizando a ponta de um microscópio de tunelamento de varredura (STM), com moléculas que podem se ligar a bases individuais de DNA enquanto colocam suas cabeças no nanopore.

p Túnel de reconhecimento, o nome Lindsay se aplica ao seu método de sequenciamento, depende de equipar um dos dois eletrodos com produtos químicos de detecção, o outro com o alvo de nucleotídeo a ser detectado. Um sinal é produzido quando a junção entre o químico de detecção e o alvo se automontam, fechando o circuito.

p Neste tipo de junção, onde os comprimentos de separação dos eletrodos estão em uma escala molecular, elétrons podem apresentar comportamento estranho associado ao mundo subatômico quântico, “Tunelamento” através de barreiras sob condições proibidas pela física clássica. Em tal cenário, cada um dos 4 nucleotídeos deve produzir uma corrente de tunelamento de assinatura, que pode ser usado para sequenciar o DNA base por base à medida que se alimenta através do nanoporo. Capturar cada base momentaneamente permite tempo para uma identificação precisa, antes de ser liberado e o fio de DNA continuar sua transmigração através do nanopore.

p Substituir o fluxo de corrente iônica por corrente de tunelamento pode potencialmente melhorar a resolução de sequenciamento consideravelmente e em seu trabalho mais recente, O grupo de Lindsay demonstra que a análise de multiparâmetros dos picos de corrente produzidos por tunelamento pode de fato identificar cada base de DNA, uma vez que é temporariamente fixada por ligações de hidrogênio entre os eletrodos funcionalizados.

p Tem mais.

p Além de identificar a identidade de nucleotídeos com mais de 90 por cento de precisão, a técnica também permite que modificações gênicas ambientais sejam identificadas, por exemplo, metilação. Isso representa um grande avanço para o sequenciamento, como tais alterações epigenéticas no genoma têm profundas implicações para o estudo da saúde e doenças humanas, incluindo o desenvolvimento embrionário e pós-natal, e câncer.

p O artigo sobre nanotecnologia descreve uma nova abordagem para analisar os sinais de tunelamento. O grupo Lindsay usou o aprendizado de máquina (o processo usado pelo Watson da IBM para vencer no Jeopardy) para treinar um computador para reconhecer as bases do DNA. A máquina chamou todas as quatro bases (A, T, C e G), bem como a "quinta base" - metil - que carrega o código epigenético, com 96 por cento de precisão em uma única molécula lida.

p “Oxford Nanopore fez um grande avanço no sequenciamento de nanopore usando corrente de íons, conforme destacado na história do NEWSFOCUS, ”Lindsay diz. “Mas achamos que podemos trazer ainda mais para a mesa com a supersensibilidade e resolução química do Túnel de Reconhecimento.”

p A Roche Pharmaceuticals licenciou recentemente a tecnologia.

p A corrida de alto risco pelo sequenciamento rápido parece estar entrando na reta final, embora novas surpresas sejam prováveis ​​antes da linha de chegada. Uma vez que é cruzado, a era da medicina personalizada terá chegado. É quase certo que muitos novos insights sobre a base genômica da saúde e das doenças humanas se seguirão.