O mundo da microscopia de varredura a laser está evoluindo rapidamente, graças ao advento de conjuntos de detectores rápidos e compactos. Essas matrizes substituem o típico detector de elemento único dos microscópios confocal de varredura a laser tradicionais, permitindo recursos novos e exclusivos.



Enquanto os detectores convencionais fornecem apenas o valor da intensidade da luz coletada, um detector pixelizado também permite registrar a distribuição espacial da luz incidente, construindo efetivamente uma pequena imagem da área iluminada para cada ponto de varredura.

A informação espacial extra fornecida pelos conjuntos de detectores permite uma técnica de super-resolução conhecida como microscopia de varredura de imagem (ISM). O ISM constrói computacionalmente uma única imagem a partir de um conjunto de dados multidimensionais brutos produzido por um microscópio. A imagem final é construída com melhor relação sinal-ruído (SNR), seccionamento óptico e resolução espacial do que um microscópio confocal tradicional.

Em detalhe, a resolução lateral da imagem ISM pode ultrapassar o limite de Abbe até um fator de dois. Estas vantagens, no entanto, são alcançadas através da exploração apenas de informação espacial; a moderna bioimagem de fluorescência pode ser ainda mais enriquecida pela aquisição resolvida no tempo, o que permite o acesso a informações estruturais e funcionais codificadas na dinâmica da fluorescência (por exemplo, tempo de vida da fluorescência).

Recentemente, pesquisadores do Instituto Italiano de Tecnologia (IIT) em Gênova desenvolveram um microscópio ISM compacto e eficaz equipado com um detector de matriz de diodo de avalanche de fóton único (SPAD) capaz de fornecer imagens estruturais e funcionais de alta resolução em uma única arquitetura. A pesquisa foi publicada em Advanced Photonics .

O detector de matriz SPAD relatado compreende 25 diodos independentes dispostos em uma grade quadrada. O tamanho pequeno e a leitura assíncrona permitem a detecção rápida de fótons fluorescentes incidentes. O esquema de aquisição de dados, baseado no método de domínio de frequência digital (DFD), é uma técnica de amostragem heteródina que permite a construção do histograma de decaimento de fluorescência com resolução de tempo de até 400 ps, ​​adequado para a maioria das aplicações de imagem de fluorescência.

A técnica é simples o suficiente para permitir o cálculo do histograma na mesma placa FPGA (field-programmable-gate-array) usada para controlar o microscópio e registrar o sinal detectado, simplificando a arquitetura do microscópio.

Graças às informações espaciais e temporais exclusivas fornecidas pelo detector de matriz SPAD, os autores demonstraram a combinação de medições de vida útil de fluorescência (FL) com ISM (FLISM). Além dos benefícios convencionais do ISM, o SNR aprimorado das imagens FLISM permite uma estimativa mais robusta do tempo de vida da fluorescência.

O relatório destaca a versatilidade do microscópio, combinando medições ISM e resolvidas no tempo com microscopia de depleção de emissão estimulada (STED), usando a técnica de separação por ajuste de vida útil (SPLIT). O resultado é uma imagem com resolução lateral aprimorada e contraste obtido sem modificar o esquema de aquisição. Além disso, as medições resolvidas no tempo permitem imagens multiespécies com um único detector para aumentar a especificidade estrutural.

O sistema pode distinguir diferentes corantes com seus valores de vida útil de fluorescência, graças à representação fasorial da dinâmica de fluorescência. Mesmo usando corantes com valores de vida semelhantes e espectros de excitação sobrepostos, ele pode distinguir os diferentes fluoróforos usando a técnica de excitação por intercalação pulsada.

Na verdade, ao alternar pulsos de excitação de laser com cores diferentes, a informação espectral é efetivamente codificada na dimensão temporal. Graças à excelente resolução temporal do microscópio proposto, a contribuição dos dois corantes fluorescentes pode posteriormente ser separada para evitar diafonia.

De acordo com Giuseppe Vicidomini, investigador principal do laboratório de Microscopia Molecular e Espectroscopia do IIT e autor correspondente, "Os resultados deste trabalho sugerem que o futuro da microscopia de varredura a laser está intimamente conectado aos detectores de matriz SPAD, capazes de enriquecer o conjunto de dados de microscopia com recursos adicionais informações espaciais e temporais sem a necessidade de alterar a arquitetura óptica de um microscópio confocal."

O trabalho demonstra que os detectores de matriz SPAD combinados com um sistema de aquisição personalizado tornam o ISM resolvido por fótons facilmente acessível e utilizável.

Mais informações: Giorgio Tortarolo et al, Microscópio de varredura de imagem com resolução de fótons compacto e eficaz, Fotônica Avançada (2024). DOI:10.1117/1.AP.6.1.016003
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