Os pesquisadores desenvolveram uma abordagem de espectroscopia Raman não invasiva e sem rótulos que pode adquirir imagens microscópicas de amostras biológicas e identificar uma ampla gama de biomoléculas com velocidade e sensibilidade sem precedentes.
"Nosso trabalho pode levar a um dispositivo não invasivo, sem rótulos e fácil de usar para uso clínico", disse o líder da equipe de pesquisa Dario Polli, do Politecnico di Milano, na Itália. “Este microscópio inovador, juntamente com algoritmos baseados em aprendizado profundo, pode eventualmente tornar mais fácil e rápido o diagnóstico de câncer, permitindo a visualização dos constituintes químicos de tecidos e células humanas”.

Na revista Optics Express , os pesquisadores descrevem sua nova técnica, que é baseada na microscopia coerente anti-stokes Raman scattering (CARS). A microscopia CARS produz imagens baseadas nas assinaturas vibracionais de moléculas explorando a interação entre pulsos de laser ultracurtos e amostras biológicas.

A nova abordagem fornece acesso à região difícil de detectar do espectro vibracional conhecida como região de impressão digital, que se estende de 400 a 1800 cm ⁻¹ . Embora muitos compostos individuais possam ser identificados usando suas impressões digitais vibracionais nesta região, ela tende a produzir sinais fracos que são difíceis de detectar.

"Técnicas comumente usadas em ciências biomédicas geralmente exigem coloração, que não é apenas complicada, mas também pode introduzir alterações estruturais e químicas que podem levar a artefatos ou erros na imagem e no processamento de dados", disse Polli. "Como nosso sistema pode distinguir entre muitas espécies químicas diferentes em tecidos biológicos sem rótulos, pode ser útil para imagens de células vivas e análise de biópsias de tecidos".

Menor taxa de repetição, geração de imagens mais rápida

Este novo trabalho faz parte do projeto CRIMSON, que visa desenvolver um dispositivo de imagem turnkey que usa espectroscopia vibracional para classificação rápida de células e tecidos. O objetivo do projeto é transformar o estudo da origem celular das doenças para permitir novas abordagens que possam avançar na terapia personalizada.

Como um passo fundamental para esse objetivo, os pesquisadores desenvolveram um microscópio CARS baseado em um laser comercial que produz pulsos ultracurtos com durações de aproximadamente 270 femtossegundos na faixa de comprimento de onda do infravermelho próximo. Eles projetaram o sistema de microscopia para usar pulsos de laser com uma taxa de repetição de 2 MHz, que é muito inferior aos 40 ou 80 MHz usados ​​pela maioria dos outros sistemas CARS.

Essa taxa de repetição mais baixa reduz o dano fototérmico à amostra porque cria um atraso de 0,5 microssegundos entre dois pulsos consecutivos. Também produz uma maior energia de pulso e intensidade de pico no ponto focal, o que gera um sinal CARS mais forte e permite uma velocidade de aquisição mais rápida.

“A vantagem mais importante da taxa de repetição mais baixa é que ela nos permitiu gerar pulsos Stokes de banda larga com desvio para o vermelho que cobrem toda a região vibracional da impressão digital usando geração supercontínua de luz branca em um cristal em massa”, disse Federico Vernuccio, estudante de doutorado. no Politecnico di Milano e primeiro autor do estudo. "Em comparação com outros métodos, esta abordagem é tecnicamente mais simples, mais compacta e robusta."

O uso de uma região espectral que é desviada para o vermelho em comparação com as configurações padrão significa que intensidades de laser mais altas podem ser usadas antes do início do fotodano. Os pesquisadores também desenvolveram novos algoritmos que combinam abordagens computacionais numéricas padrão com inteligência artificial. Esses algoritmos recuperam mais informações dos dados adquiridos e as transformam em imagens que permitem distinguir facilmente diferentes espécies químicas.

"Graças às nossas melhorias, o sistema CARS oferece imagens de alta qualidade com velocidade de aquisição de última geração", disse Vernuccio. "Nosso sistema tem um tempo de permanência de pixel de menos de 1 milissegundo sem comprometer a integridade da amostra. Essa velocidade é limitada pela taxa de atualização do espectrômetro."

Sensibilidade de alta velocidade

Para testar seu sistema, os pesquisadores usaram amostras de referência para comparar os espectros recuperados com o novo microscópio com os adquiridos usando uma técnica de espectroscopia vibracional de última geração, embora mais lenta. Os dois métodos mostraram excelente concordância, demonstrando que o novo sistema pode fornecer espectros em velocidades muito altas com boa resolução espectral e especificidade química.

Os pesquisadores então determinaram o limite de detecção de seu sistema adquirindo espectros CARS de um conjunto de soluções de dimetilsulfóxido com várias concentrações. O sistema foi capaz de medir a concentração química com a sensibilidade sem precedentes de 14,1 mmol/litro, cerca do dobro da sensibilidade de outros sistemas CARS que trabalham na região da impressão digital.

Eles também mostraram a capacidade do sistema de distinguir e localizar espacialmente várias esferas plásticas transparentes de tamanho mícron com base em sua assinatura vibracional e fizeram medições em tecidos biológicos para demonstrar que a técnica funciona em amostras biológicas sem induzir danos.

"Nosso microscópio CARS permite imagens sem rótulos com especificidade química em velocidades mais altas, tornando a imagem Raman de células vivas mais viável", disse Polli. "Isso pode permitir que nosso sistema seja usado para analisar as interações das células cancerígenas com as células do sistema imunológico ou para caracterizar como a quimioterapia afeta as células, por exemplo".

Os pesquisadores agora estão trabalhando para melhorar seu sistema criando uma faixa de comprimento de onda ainda mais ampla de pulsos de Stokes por meio da geração supercontínua de luz branca. Isso melhoraria tanto a velocidade da imagem quanto o número de analitos químicos detectáveis. Eles também estão trabalhando para a comercialização desenvolvendo software amigável, fontes ópticas compactas e projetos para um protótipo comercial e sistema de detecção. + Explorar mais

Espectroscopia vibracional de impressão digital THz em uma taxa espectral ultrarrápida