uma, Um feixe de laser colimado é entregue na configuração por um divisor de feixe (BS) e em um espelho de varredura galvanométrica (GSM), que é capturada no plano focal posterior de uma objetiva aérea (OBJ1). A varredura do GSM rasta o foco em uma dimensão, conforme mostrado pela seta de duas pontas no espaço focal frontal em caixa de OBJ1. Um espelho retrovisor reflete a luz com diferentes quantidades de desfoque de volta para a objetiva, que então viaja através das lentes para o GSM, onde é retirado o escaneamento por, que remove o movimento de varredura lateral e apenas o componente axial permanece. O GSM é então novamente capturado no plano focal posterior de uma objetiva de imersão em água (OBJ2). OBJ2 forma uma imagem livre de aberrações do foco (como formada por OBJ1) no espaço da amostra. b, Ampliado na visão da região em caixa de a. O painel à esquerda mostra o foco da luz em seu foco nominal. As setas pretas mostram o retorno dos raios marginais após a reflexão. Cada passo no espelho resulta em um ponto de foco no plano de amostra com uma posição axial deslocada. c, Configuração alternativa com espelho inclinado que permite varredura axial contínua. Aqui, a objetiva remota OBJ1 é ligeiramente deslocada para fora do eixo óptico para criar um foco inclinado que é normal para a superfície do espelho. A varredura desse foco lateralmente resulta em uma mudança de foco, conforme ilustrado pelas setas pretas Crédito:Tonmoy Chakraborty, Bingying Chen, Stephan Daetwyler, Bo-Jui Chang, Oliver Vanderpoorten, Etai Sapoznik, Clemens Kaminski, Tuomas P.J. Knowles, Kevin M. Dean, e Reto Fiolka
Em microscopia óptica, a imagem volumétrica de alta velocidade é limitada pela taxa de varredura axial lenta ou aberrações introduzidas pelo mecanismo de varredura z. Para superar essas limitações, cientistas da UT Southwestern introduziram um novo design óptico que transforma um movimento de varredura lateral em uma varredura na terceira dimensão. Seu microscópio realizou focagem de laser a uma taxa de 12 kHz e permitiu a observação da dinâmica rápida dentro das células e do coração batendo em embriões de peixe-zebra.
A imagem rápida é de grande interesse em microscopia, visão de computador, e usinagem a laser. Por exemplo, na neurociência, a imagem volumétrica de alta velocidade é essencial para monitorar processos biológicos dinâmicos, incluindo atividade de voltagem de membrana (com dinâmica na escala de tempo de 1 ms ou menos) ou fluxo sanguíneo cerebral. A rapidez com que se consegue a imagem está intimamente ligada à rapidez com que se pode mudar a posição do foco do sistema de imagem, particularmente na terceira dimensão.
As formas tradicionais de refocar o fazem movendo mecanicamente a objetiva do microscópio ou a amostra, o que leva a uma baixa velocidade de varredura na terceira dimensão, já que a velocidade dos objetos físicos em movimento é limitada pela inércia. Uma forma potencial de aliviar esse problema é por meio de foco remoto, que realiza a reorientação alterando a frente de onda do sistema óptico. Contudo, a maioria das tecnologias existentes enfrenta a compensação entre resolução e velocidade. Como tal, permanece a necessidade de uma tecnologia de varredura 3-D capaz de atingir taxas de multi-kHz, evitando aberrações que reduziriam sua resolução.
Em um manuscrito publicado em Ciência leve e aplicações , uma equipe de cientistas, liderado pelo Professor Reto Fiolka do Departamento de Biologia Celular e Lyda Hill Departamento de Bioinformática, no UT Southwestern Medical Center, Dallas, TX, EUA., e colegas de trabalho desenvolveram um novo design óptico para superar esses desafios. Eles empregaram tecnologias de varredura lateral bem estabelecidas e transformaram o movimento de varredura lateral em reorientação na terceira dimensão para realizar imagens volumétricas de alta velocidade. Eles pegaram o conceito de foco remoto livre de aberrações, e em vez de mover um espelho remoto correspondente na terceira dimensão, eles escanearam um ponto de laser lateralmente com um galvanômetro de alta velocidade sobre um espelho estacionário. Se a distância entre o espelho estacionário e a lente objetiva não for constante ao longo da direção da varredura, uma desfocagem será introduzida conforme necessário para a refocagem remota. Além disso, no caminho de retorno, o componente de varredura lateral é perfeitamente compensado, de modo que um movimento de varredura puro na terceira dimensão seja obtido. Deste modo, os pesquisadores foram capazes de aproveitar as tecnologias de varredura lateral de alta velocidade para mover rapidamente um foco de laser de alta resolução na terceira dimensão.
uma, Nanopartículas multiméricas geneticamente codificadas dentro de duas células MV3, conforme imageado pelo ASLM em tempo de integração de imagem de 20 ms, e 3,57 volumes por segundo. b, Vista YZ da região perinuclear. Círculos amarelos indicam vesículas detectadas e linhas azuis ilustram trilhas cumulativas. c, Desenho esquemático de embrião de peixe-zebra. d, Seção transversal XZ média (mais de 30 ciclos) do coração de peixe-zebra, adquirido com uma taxa de quadros de 45 Hz. e, Kymograph de coração batendo, medido ao longo da linha mostrada em d. Kymograph usa dados brutos e nenhuma média foi aplicada. f, Imagem volumétrica de um coração de peixe-zebra a uma taxa de volume de 7,4 Hz, Visualização XY com profundidade codificada em cores. Barra de escala, uma, 10 mícrons; b, 1 mícron; d, e 20 microns Crédito:Tonmoy Chakraborty, Bingying Chen, Stephan Daetwyler, Bo-Jui Chang, Oliver Vanderpoorten, Etai Sapoznik, Clemens Kaminski, Tuomas P.J. Knowles, Kevin M. Dean, e Reto Fiolka
Duas implementações usando um espelho passo e um espelho plano inclinado, foram adotados para concretizar este conceito. O primeiro permite tamanhos de etapas axiais arbitrariamente grandes ao longo de um número finito de etapas, e o último permite um número arbitrário e tamanho de etapas axiais e é capaz de digitalização contínua na terceira dimensão, embora em uma faixa de varredura mais limitada. Com as duas implementações, os cientistas apresentam aplicações desta tecnologia:
"Nossa primeira demonstração prática em imagens microscópicas foi acelerar a microscopia de folha de luz por varredura axial (ASLM), que foi criticado por sua baixa velocidade de aquisição (taxa de quadros de cerca de 10 Hz em implementações de alta resolução, anteriormente). Nossa nova tecnologia de varredura permite uma aceleração de ordem de magnitude enquanto mantém o alto poder de resolução espacial desta tecnologia de imagem emergente. Em uma segunda aplicação, implementamos nossa tecnologia de varredura em um microscópio de varredura raster de 2 fótons e realizamos imagens volumétricas de alta resolução com uma taxa de varredura na terceira dimensão de 12 kHz. De fato, nesta resolução espacial, nossa abordagem é 6 vezes mais rápida do que as tecnologias de focalização sem aberrações relatadas anteriormente. Em seguida, demonstramos o potencial de nossa tecnologia para microscopia intravital por imagens do coração batendo de um embrião de peixe-zebra. Acreditamos que isso abre grandes aplicações para imagens intravitais, especialmente nas neurociências. "
"Ambas as tecnologias de varredura discreta e contínua podem encontrar muitas aplicações para obter imagens de diferentes camadas do cérebro quase simultaneamente ou para adquirir rapidamente volumes inteiros para medir padrões de disparo neuronal ou fluxo sanguíneo cerebral. nossa abordagem é totalmente compatível com defletores acústico-ópticos e, portanto, teoricamente capaz de escanear na escala de tempo de sub-microssegundos (por exemplo,> 1 MHz) na terceira dimensão. Assim, usando padrões de varredura ressonantes de Lissajous, prevemos a possibilidade de imagens volumétricas em taxas de kHz ”, prevêem os cientistas.
