As membranas celulares consistem em fosfolipídios e proteínas aderidas ou incorporadas. As proteínas da membrana desempenham papéis vitais no metabolismo e na vida da célula. Você não pode usar microscopia comum para visualizar ou caracterizar proteínas de adesão, proteínas de transporte e canais de proteínas na membrana celular. Usando microscopia eletrônica e uma técnica chamada "fratura por congelamento", que separa as membranas celulares congeladas, permite a visualização da estrutura da membrana e a organização de proteínas dentro do mar de fosfolipídios. Combinar outros métodos com a fratura por congelamento não só nos ajuda a entender a estrutura de diferentes membranas celulares e proteínas de membrana, mas permite a visualização e análise detalhada da função de proteínas, bactérias e vírus específicos.
Etapas Básicas da Fratura Congelante br>
Utilizando nitrogênio líquido, amostras de tecidos biológicos ou células são rapidamente congeladas para imobilizar os constituintes celulares. As membranas celulares são compostas por duas camadas de fosfolipídios, chamadas de bicamada, onde as caudas lipídicas hidrofóbicas ou que odeiam água apontam para o interior da membrana e as extremidades hidrofílicas, ou que amam a água, da molécula lipídica apontam para fora e na direção o interior da célula. A amostra congelada é rachada ou fraturada com um micrótomo, que é um instrumento semelhante a uma faca para cortar fatias finas de tecido. Isso faz com que a membrana celular se separe com precisão entre as duas camadas, porque a atração entre as caudas lipídicas hidrofóbicas representa o ponto mais fraco. Após a fratura, a amostra é submetida a um procedimento de vácuo, chamado "freeze etching". A superfície da amostra fraturada é sombreada com carbono e vapor de platina para fazer uma réplica estável, que segue os contornos do plano da fratura. O ácido é usado para digerir o material orgânico aderido à réplica, deixando uma fina camada de platina na superfície da membrana fraturada. Esta casca é então analisada por microscopia eletrônica.
Freeze Etching
Freeze etching é a secagem a vácuo de uma amostra biológica unfixed, congelada e congelada-fraturada. O processo de secagem a vácuo é semelhante ao congelamento de frutas e vegetais que são embalados e vendidos em mercearias. Sem congelamento, muitos detalhes da estrutura celular são obscurecidos pelos cristais de gelo. A etapa de gravação profunda ou congelada melhora e amplia o método original de fratura por congelamento, permitindo a observação das membranas celulares durante várias atividades. Ele permite a análise não só da estrutura da membrana, mas também dos componentes intracelulares e fornece informações estruturais detalhadas sobre bactérias, vírus e grandes complexos de proteínas celulares.
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Crie o suporte (quase) perfeito: Como criar o (quase) suporte perfeito: Veja como a microscopia eletrônica
A microscopia eletrônica pode revelar e ampliar mais de um milhão de vezes os menores organismos ou estruturas, como bactérias, vírus, componentes intracelulares e até proteínas. A visualização é criada bombardeando uma amostra ultrafina com um feixe de elétrons. Os dois métodos de microscopia eletrônica são microscopia eletrônica de varredura, ou MEV e microscopia eletrônica de transmissão, ou TEM. Amostras de fratura congelada são rotineiramente analisadas com TEM. TEM tem melhor resolução do que SEM e oferece informações estruturais de até 3 nanômetros de réplicas. O desenvolvimento e uso de microscopia eletrônica de fratura por congelamento mostraram que as membranas plasmáticas das células são compostas de bicamadas lipídicas e esclareceu como as proteínas são organizadas dentro das membranas celulares. A fratura por congelamento dá uma visão única do interior das membranas celulares, porque divide e separa os fosfolipídios da membrana em duas folhas ou faces opostas e complementares. Nos mais de 50 anos desde a introdução da primeira máquina de fratura por congelamento, a fabricação de uma réplica de platina ainda é a única maneira de obter informações estruturais sobre a membrana celular. A técnica mostra se proteínas específicas flutuam ou estão ancoradas na membrana celular, e se e como algumas proteínas se agregam. Um novo método - usando anticorpos direcionados para proteínas específicas - é combinado com a fratura por congelamento para identificar proteínas e sua função na membrana celular.
