Ao combinar as tecnologias CRAGE e CRISPR, os pesquisadores têm um método muito mais fácil para caracterizar metabólitos secundários. Crédito:Biologia Química Celular (2021). DOI:10.1016/j.chembiol.2021.08.009
Metabólitos secundários microbianos, aquelas moléculas que não são essenciais para o crescimento, mas essenciais para a sobrevivência, podem agora ser mais fáceis de caracterizar após um estudo de prova de conceito no qual os pesquisadores emparelharam as tecnologias CRISPR e CRAGE.
Embora o CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) seja a principal ferramenta para editar genomas com precisão, sua eficácia tem sido historicamente limitada devido à falta de ferramentas robustas disponíveis para transportar CRISPR em microrganismos. CRAGE (Chassis-independent Recombinase-Assisted Genome Engineering) é uma técnica que os pesquisadores podem usar para integrar grandes cargas genéticas diretamente em diversos micróbios.
A combinação do CRAGE com o CRISPR fornece aos pesquisadores uma adição poderosa ao seu kit de ferramentas para estudar a função dos genes. Como demonstração, os pesquisadores usaram o CRAGE-CRISPR para descobrir metabólitos secundários ativos e ajudá-los a identificar e descrever as funções dos agrupamentos de genes biossintéticos que os produzem.
Os metabólitos secundários são compostos microbianos produzidos em resposta a dificuldades ou competição. Eles constituem a base para uma série de produtos vitais em biotecnologia, medicina, agricultura e outras indústrias - mas ainda há muito sobre eles que não sabemos.
Desbloquear o poder dos metabólitos secundários pode ser complicado porque os BGCs que os produzem não podem ser ativados em ambientes de laboratório. O CRAGE fez algum progresso na superação desse obstáculo quando entrou em cena em 2019. Agora, esse poder está prestes a crescer exponencialmente combinando-o com o CRISPR.
Ao empregar o CRAGE, os pesquisadores não estão mais limitados a usar micróbios hospedeiros modelo; teoricamente, qualquer micróbio pode servir como fábrica para a produção de compostos químicos de interesse. Usando o CRAGE para domesticar micróbios alvo, os usuários do JGI podem então empregar o CRISPR em uma variedade de hospedeiros microbianos.
Photorhabdus luminescens prova fatal para insetos. Ele é transportado por um nematóide infeccioso e libera toxinas na corrente sanguínea do inseto que matam rapidamente o hospedeiro. Entender exatamente como o P. luminescens e seus metabólitos secundários funcionam pode gerar novas ferramentas para o controle de pragas.
Os metabólitos secundários são altamente regulados nas bactérias, dificultando a identificação de qual via corresponde a qual metabólito. Encontrar um veículo pelo qual introduzir o CRISPR no micróbio é fundamental, porque permite que os pesquisadores excluam ou ativem certos genes e avaliem como essas edições afetam a funcionalidade.
O CRAGE permite o transplante desses BGCs de um organismo para um hospedeiro alternativo por meio de uma plataforma de pouso que consiste em um gene de recombinase cre e locais lox mutuamente exclusivos. Em última análise, esse processo permite que os pesquisadores identifiquem cepas capazes de produzir metabólitos secundários em um ambiente de laboratório, iluminando essa "matéria escura biológica".
Também oferece a CRISPR um ponto de entrada. Ao usar o CRISPR para eliminar ou ativar genes, os pesquisadores do JGI conseguiram monitorar a perda e o ganho de função. Os dados analíticos do estudo mostram picos e vales nos metabólitos secundários à medida que os genes são editados. Com a ajuda do CRAGE, o emparelhamento provou rapidamente confirmar a produção aprimorada de 22 metabólitos de seis agrupamentos de genes biossintéticos. Um deles era um metabólito de um cluster de genes biossintéticos anteriormente não caracterizado. Esse trabalho dos pesquisadores do JGI foi publicado em abril de 2022 em
Cell Chemical Biology .
Quando se trata especificamente do exterminador de insetos P. luminescens, a compreensão de seus metabólitos secundários e seus caminhos pode alimentar outras aplicações agrícolas para controle de pragas e entender como o patógeno usa insetos como combustível.
O impacto do emparelhamento pode vir a ser muito mais abrangente. A compatibilidade de CRAGE e CRISPR poderia potencialmente permitir a introdução de CRISPR em outras bactérias, aumentando assim a compreensão da comunidade científica de como os metabólitos secundários são produzidos e como alavancar seus poderes na agricultura, produtos farmacêuticos, biocombustíveis e outros.
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