p A eletroforese em gel de poliacrilamida permite a separação de alta resolução de proteínas extraídas de amostras biológicas, mas requer mais de um dia de pré-tratamento para recuperar as proteínas separadas presas dentro do gel para detecção por espectrometria de massa. BAC-DROP, nossa nova tecnologia de eletroforese, usa uma forma solúvel de gel de poliacrilamida, o que permite que o pré-tratamento da amostra seja concluído em cerca de cinco horas. A tecnologia desenvolvida permitirá o diagnóstico rápido de vírus e marcadores de proteínas de doenças. p A espectrometria de massa (MS) é um método poderoso para análise de biomarcadores porque permite a medição altamente sensível e precisa de moléculas-alvo em amostras clínicas. A aplicação da EM ao diagnóstico clínico, como triagem metabólica neonatal, vem progredindo com foco em marcadores metabólicos. A medição de MS de proteínas é atualmente usada principalmente para novos estudos de descoberta de marcadores, mas há um interesse crescente em sua aplicação no diagnóstico de marcadores clínicos como alternativa aos imunoensaios.

p A quantificação baseada em MS de biomarcadores de proteína é realizada principalmente por uma abordagem ascendente usando fragmentos de peptídeos obtidos por digestão enzimática de proteínas com tripsina. Os protocolos de digestão padrão requerem um tempo de reação de mais de 20 horas, que é um fator de limitação de taxa em fluxos de trabalho de preparação de amostra.

p Embora a quantificação de proteínas por MS seja altamente sensível, plasma e proteoma sérico são altamente complexos, e a interferência de outros componentes representa um desafio significativo. Para detecção de alta precisão de marcadores de alvo, abordagens para a pré-remoção dos principais componentes da proteína sérica, como albumina ou enriquecimento seletivo de marcadores alvo usando colunas de anticorpos, foram relatadas, mas o efeito fora do alvo nos resultados quantitativos e a dificuldade de processar várias amostras permanecem obstáculos.

p Neste estudo, focamos em géis de poliacrilamida solúveis usando N, N'-Bis (acriloil) cistamina (BAC) como um reticulador para resolver esses problemas. Os géis de poliacrilamida reticulada BAC se dissolvem prontamente por tratamento de redução, permitindo a recuperação de proteínas que escaparam para a solução. Descobrimos que as proteínas recuperadas eram adequadas para uma digestão rápida de tripsina em condições de alta temperatura, e conseguimos estabelecer um método de preparação de amostra de alto rendimento para a quantificação de biomarcadores com base em MS, que denominamos BAC-DROP (BAC-Gel Dissolution to Digest PAGE-Resolved Objective Proteins).

p O fracionamento de proteoma de alta resolução com BAC-DROP é particularmente eficaz para a quantificação de MS de proteínas marcadoras de rastreamento direcionadas derivadas de amostras clínicas. Ao introduzir BAC-DROP no fluxo de trabalho de quantificação baseado em MS do biomarcador inflamatório da proteína C reativa (CRP), fomos capazes de completar o pré-tratamento da amostra em apenas 5 horas e quantificamos com sucesso a CRP de uma amostra de 0,5 µL de soro humano. Também obtivemos sucesso no diagnóstico sorológico de infecção pelo vírus da hepatite B (HBV) pela quantificação de HBsAg combinada com BAC-DROP e MS. Recentemente, o interesse no diagnóstico de infecções virais na EM tem aumentado rapidamente, como exemplificado pelo diagnóstico de COVID-19. A abordagem de preparação de amostra de alto rendimento por BAC-DROP mostrada neste estudo será aplicável não apenas ao HBV, mas também a outras amostras de doenças virais infecciosas.